ミトコンドリアヘムからの保存されたアロステリーの構造的差異に基づく抗生物質の同定

Nature Communications volume 13、記事番号: 7591 (2022) この記事を引用

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この記事に対する著者の訂正は 2022 年 12 月 21 日に公開されました

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抗菌薬耐性 (AMR) は世界的な健康問題です。過去 10 年間に多大な努力が払われてきたにもかかわらず、薬剤耐性のある淋菌を含む一部の種による脅威は増大し続けており、治療不可能になる可能性があります。異なる作用機序を持つ抗生物質の開発が切実に求められています。今回、我々は、生命にとって必須の呼吸酵素である真核生物のミトコンドリアヘム銅オキシダーゼ（HCO）の内部に埋もれたアロステリック阻害部位を特定した。 HCO の結合ポケット周囲の立体構造は細菌と真核生物の間で高度に保存されていますが、後者には余分なヘリックスがあります。保存されたアロステリーのこの構造の違いにより、細菌性 HCO 特異的阻害剤、つまりセフトリアキソン耐性淋菌に対する抗生物質化合物を合理的に同定することができました。共鳴ラマン分光法およびストップドフロー分光法と組み合わせた分子動力学により、阻害のメカニズムとして基質アクセスチャネルにおけるアロステリック閉塞が明らかになりました。私たちのアプローチは、タンパク質の機能を調節する新たな道を開き、AMRを克服するための選択肢を広げます。

抗菌薬耐性（AMR）は世界的な健康問題です1。 2013 年以来、世界中で AMR の脅威を軽減するために多くの努力が払われてきましたが、それでも一部の種による脅威は増加し続けています。薬剤耐性のある淋菌は、5 つの緊急脅威の 1 つです 2,3。ほとんどの国で淋菌に対する経験的第一選択抗生物質の最後の選択肢であるセフトリアキソンに対する耐性が報告されており、世界中で出現し続けています4。高度のAMRにより淋菌感染症は治療不能になる可能性があり、不妊症、子宮外妊娠、HIV感染の増加などの重篤な合併症が増加します。現在利用可能な抗生物質に対する耐性を有する病原体の出現は非常に憂慮すべきことです。したがって、AMR に取り組むには治療選択肢の開発が不可欠です。

呼吸鎖は、抗生物質の潜在的な標的として最近かなりの科学的注目を集めています。 AMR を克服する武器として、呼吸鎖を標的とする化合物、たとえば寄生虫、真菌、特に薬剤耐性結核菌に対する薬剤が承認または臨床試験に入っています 5、6、7、8、9、10。しかし、それらのほとんどはオルソステリック部位の競合阻害剤です。呼吸酵素は生命にとって不可欠であるため、その中心構造は通常、種を超えて保存されています。宿主タンパク質との構造類似性と基質の共通性は交差反応のリスクとなり、副作用の原因となる可能性があります11。したがって、アロステリック部位は進化の過程でオルソステリック部位よりもアミノ酸配列の保存性が低く、理論的には選択性が向上し、毒性が軽減されるため、アロステリック阻害剤がより実現可能な選択肢となります 12,13。しかし、特に膜タンパク質に対するアロステリック阻害剤の体系的かつ戦略的な探索はまだ確立されていません。ほとんどの呼吸酵素は膜タンパク質です。

HCO は、細菌、古細菌、真核生物という生命の 3 つの領域すべてに存在する終末呼吸酵素です。 HCO は呼吸鎖から電子を受け取り、酸素分子を水に還元します。この発エルゴン反応は、膜を横切るプロトンのポンピングと結びついており、ATP 生成にさらに使用されるプロトン原動力の維持に貢献しています 14、15、16、17、18。 HCO はマルチサブユニット複合体であり、その構成は種によって異なります。ただし、サブユニット I はすべての HCO に共通の触媒サブユニットです。これには、低スピンのヘムと、高スピンのヘムと銅イオンによって形成される触媒部位である二核中心 (BNC) が含まれています。低スピンのヘムは最初に電子を受け取り、酸素を還元するために電子を BNC に渡します 16、17、18、19。

真核生物は、アルファプロテオバクテリアと古細菌との共生に由来します20。したがって、真核生物の HCO に類似した、ミトコンドリア DNA にコードされるミトコンドリアシトクロム C オキシダーゼ (mtCcO) のサブユニット I から III は、細菌由来の呼吸酵素の子孫であり 20,21 、機能的に重要な残基であるため、それらのコア構造は保存されています。残りの残基は同じではありません。さらに、哺乳類の mtCcO には、ゲノム DNA によってコードされるさらに 10 個のサブユニットがあります。これらのサブユニットの生理学的役割は完全には解明されていません 16。 RNAポリメラーゼやリボソームなどの基本タンパク質のコア構造も種間で類似しています。興味深いことに、彼らは分子進化に沿って機能を調節する追加のサブユニットを獲得しました22,23。したがって、哺乳類では追加のヘリックスで覆われている HCO のコア構造の表面にはアロステリック部位が含まれており、その活性をプラスまたはマイナスに制御しているのではないかという仮説を立てました。哺乳動物の mtCcO には追加のヘリックスが存在するため、ポケットは細菌の HCO とは区別されます。

この研究では、真核生物の mtCcO 内に埋もれたアロステリック阻害部位を特定します。 HCO の結合ポケット周囲の立体構造は細菌と真核生物の間で高度に保存されていますが、後者には余分なヘリックスがあります。保存されたアロステリーの構造の違いにより、細菌性 HCO 特異的阻害剤、つまりセフトリアキソン耐性淋菌に対する抗生物質化合物を合理的に同定することが可能になります。

この仮説を検証するには、まずアロステリック阻害部位を特定する必要があります。私たちは、ランダムな化合物スクリーニングによって得られた哺乳動物の mtCcO 阻害剤から開始しました。我々は以前、内在性タンパク質が mtCcO と直接相互作用し、mtCcO 活性をアロステリックに調節することを発見しました 24,25。この発見により、我々は mtCcO 活性を調節するランダム化合物スクリーニングを実行することになりました。私たちは、一酸化炭素、一酸化窒素 (NO)、シアン化物などの既知の阻害剤とは化学的に異なる mtCcO 阻害剤を同定しました。酵素動態を研究した後、いくつかのアロステリック阻害剤を選択しました（補足図1a〜d）。次に、mtCcO と阻害剤の複雑な結晶構造を取得しようと試みました。その結合部位は哺乳類特有のヘリックスであるCOX7C内に埋め込まれているため、我々は今後T113に焦点を当てました（図1a、b）。分解能 2.2 Å の X 線回折データは、T113 に浸した mtCcO 結晶から得られました。また、同じ調製条件下で mtCcO のアポ構造を決定しました (補足表 1)。得られた複合構造は、タンパク質と比較して追加の電子密度を与える明確な化合物結合部位を示し、mtCcOの内部に明らかに見られました（補足図2a）。 Fo（T113）-Fo（DMSO）差分マップは、この電子密度が水または脂質分子に由来しないことを確認し、最も高い差を示しました（補足図2b）。この結合ポケットは、酸素分子やシトクロム c の結合部位、電子伝達経路、プロトン経路、酸素アクセスチャネルの経路とは異なっており 16,19 であり、T113 が真のアロステリック阻害剤であることが示唆されています。

T113 を含む mtCcO の X 線構造。 1σ で等高線化された電子密度マップ (2Fo – Fc) を左に示します。球内に T113 を含む mtCcO のリボンモデルを右に示します。 T113 は COX7C (赤) で覆われ、表面から見えなくなりました。 b 膜間空間から見ると、T113は4つの膜貫通ヘリックス（TM1〜3、COX7C）に囲まれ、表面から埋められていました。タンパク質分子の表面は、拡大図では灰色で表示されます。アロステリック部位を囲むサブユニット I の 3 つのヘリックスは濃い青で示され、サブユニット I の他のヘリックスは淡い青で示され、mtCcO のサブユニット COX7C は赤で示されます。

mtCcO のアロステリック部位を囲む 4 つのヘリックスのうち 3 つは、HCO に共通するサブユニット I に属します。さらに、低スピンヘム近くのヘリックスの立体構造が細菌HCOでよく保存されていることにも気づきました（図2aおよび補足図3）。これらの観察により、我々は、細菌オキシダーゼの対応するアロステリック部位を標的とする可能性が高いmtCcO阻害剤の誘導体からアロステリック阻害剤を合理的にスクリーニングできると仮定しました。

a ミトコンドリア mtCcO (左) と大腸菌 bo3 UqO (中央) のアロステリック部位。サブユニット I のヘリックスは青、サブユニット I の TM0 は紫、サブユニット COX7C は赤、その他のヘリックスは黄色で示されています。結合されたビュー (右) は E. coli bo3 UqO を灰色で示しています。 COX7C は阻害剤をカバーするのに十分な距離にあります。サブユニット I のすべてのヘリックスは、TM0 を除き、mtCcO と大腸菌 bo3 UqO の間で融合されています。 b 大腸菌 bo3 UqO に対する 50 μM での 434 種類の化学物質のスクリーニング。データは重複の平均として表示されます。 c bo3 UqO 酵素活性に特異的な N4 の用量依存的な阻害。データは、2 回の独立した実験にわたる技術的反復の平均値として示されています。 d DMSO および 25 μM N4 分子を使用した bo3 UqO の動態解析。フィッティングラインは、非競合阻害モデルを使用したミカエリス・メンテン方程式を使用して計算されます。データは技術的反復の平均値として表示されます。再現性は 2 つの独立した実験によって確認されました。ソースデータはソースデータファイルとして利用できます。

カスタムライブラリーの調製のために、最初のハイスループットスクリーニングで得られた、T113 および T151 を含む 2 つの mtCcO 阻害剤に由来するインシリコ化合物スクリーニングを適用しました。 T151 はアロステリック部位に結合することもわかりました (補足図 1d)。これらと構造的に類似した化合物は、主に、8,000 万の市販化合物から複数のリガンドベースの検索アルゴリズムによって収集されました。次に、当社の社内アルゴリズムがそれらを統合し、ランク付けし、285 の化合物の最初のシリーズを選択しました 26,27。ドッキングシミュレーションによって選択された 149 化合物の 2 番目のセットを追加しました。これは、mtCcO のアロステリックポケットに対して同じ 8,000 万の化合物をスクリーニングしました。合計で、HCO の保存されたアロステリック部位に結合する可能性が高い 434 個の化合物からなるカスタムライブラリを確立しました。このライブラリを mtCcO に対してテストした結果、47 の化合物が 50 μM で mtCcO を 40% 以上阻害しました (11.4%)。これはランダムスクリーニングによる通常のヒット率よりも高く、カスタムライブラリが mtCcO 阻害剤を濃縮していることが証明されました (補足図4a)。

私たちは大腸菌 bo3 ユビキノールオキシダーゼ (bo3 UqO) を使用して、モデル細菌 HCO としての仮説を検証しました。当社のカスタムライブラリーを bo3 UqO に対してスクリーニングしたところ、50 μM で bo3 UqO に対して >40% の阻害を示した 15 個のヒット化合物が得られました (図 2b)。その中で、mtCcOとbo3 UqOの両方に対する8つの共通阻害剤、そしてより重要なことに、bo3 UqOに対する2つの特異的阻害剤の取得に成功した（図2c）。予想通り、これらの阻害剤の 1 つである N4 は、ミカエリス・メンテン式によって評価されたアロステリック阻害曲線によく適合しました (図 2d)。

N4が対応するアロステリック部位に結合するという直接的な証拠を得るために、極低温電子顕微鏡（cryo-EM）を使用して3.0Åの分解能でFabフラグメントを使用してN4結合bo3 UqOの構造を決定しました（図3a、補足図5e-） h、および補足表 2)。また、同じ調製条件下で 3.1 Å で bo3 UqO のアポ構造を決定しました（補足図 5a-d）。ホロ構造とアポ構造の間の差分マップは、明示的な追加密度を実証し、この密度は見つかった最大の差でした（補足図5i）。特に、結合部位は表面に露出し、サブユニット I の膜貫通ヘリックス 1 (TM1)、TM2、および TM3 に隣接しており、これは我々の仮説を強く裏付けています (図 3b、c)。 Asp75、Arg71、および N4 の間には水素結合がありました。結合部位の静電ポテンシャル表面は、bo3 UqOがmtCcOよりも親水性の表面を有することを示し、疎水性T113がbo3 UqOに結合する可能性が低いことを示唆しています（図3d）。一方、比較的親水性の高いN4は、より疎水性の環境であるmtCcOアロステリックポケットに対する適切な結合剤ではなく、N4がT113の誘導体であるにもかかわらず、それぞれbo3 UqOまたはmtCcOに対して相互に排他的な阻害剤であることを説明している。構造内の阻害剤周囲のアミノ酸残基の変異体は阻害効果の有意な変化を示し、N4がポケットでbo3 UqOに決定的に結合することが確認されました（補足図5j）。

N4 と複合体を形成した bo3 UqO のクライオ EM 密度マップ (左) とリボンモデル (右) (左が赤、右が球)。 bo3 UqO のアロステリックサイトが露出します。 b bo3 UqO のアロステリック部位にある N4 分子。 N4 付近のクライオ EM 密度マップを赤色で示します。 Asp75、Arg71、および N4 の間の分子相互作用は点線で示されています。 c N4 は地表からアクセス可能です。ヘム b の Fe 面のタンパク質分子表面は灰色で示されています。 N4 分子全体が表示されました。 d bo3 UqO (左) と mtCcO (右) のアロステリックサイトの静電ポテンシャル面。 e 野生型大腸菌（Wild）、bo3 UqO ノックアウト株（Δbo3）、および bo3 UqO 依存株（Δbd）の 24 時間培養における N4 による増殖阻害。 f 時間および濃度に依存する生存率アッセイ。点線は接種 (1 × 105 CFU/ml) を示します。データは生物学的な 3 連 (e) または 2 連 (f) によって確認されます。ヘリックスの色は図 2 と同じです。ソースデータはソースデータファイルとして入手できます。

細菌性 HCO の特異的阻害剤は、抗生物質としての可能性を秘めています。この可能性をテストするために、N4 による大腸菌増殖の阻害を評価しました。大腸菌には、呼吸鎖の末端オキシダーゼに bo3 UqO とシトクロム bd オキシダーゼ (bd UqO) の 2 つの分岐があります。大腸菌は環境への適応として、好気条件では bo3 UqO を使用しますが、低酸素条件では bd UqO を優先的に使用します 28。野生型大腸菌では、増殖における N4 の影響はありませんでした。ただし、bo3 UqO依存株における大腸菌の増殖は大幅に減少しました（図3e）。この増殖阻害は bo3 UqO ノックアウト株ではキャンセルされ、N4 による増殖阻害は非特異的効果ではなく HCO 阻害の結果であることが確認されました。化合物の殺菌効果と静菌効果を区別するために、コロニーカウントアッセイを実行したところ、大腸菌に対する阻害剤N4の効果は静菌であることがわかりました（図3f）。

次に、我々の発見を拡張するために、病原菌ナイセリア属の HCO の遠いファミリーメンバーであるキノール依存性 NO レダクターゼ (bb3 qNOR) をテストしました。ナイセリア属において、多剤耐性淋菌の出現と蔓延は、世界的な健康上の重大な懸念となっている29。 qNOR は NO を亜酸化窒素 (N2O) に還元し、無酸素状態で窒素化合物を酸化してエネルギーを生成する脱窒において重要な酵素です 30。細菌の脱窒は、宿主免疫細胞によって生成される外因性 NO から細菌を保護する上でも重要な役割を果たしており、それによって髄膜炎菌や淋菌などのいくつかの細菌種の病原性に関与していると考えられています 31,32。これらは、ナイセリア属の qNOR が薬物標的となり得ることを示唆しています。 N. meningitidis qNOR と N. meningitidis qNOR のアミノ酸配列が 98%、特に膜貫通領域で 100% 同一であり、重要なことに N. meningitidis qNOR の構造が解明されているため、N. meningitidis qNOR を使用しました 33。我々は、低スピンヘムの周囲の3つのヘリックス（bb3 qNORのTM 3-5）の立体構造がbb3 qNORでも保存されていることを確認しました（図4a）34。 bo3 UqO と同じアプローチを bb3 qNOR に採用しました。まず、bb3 qNOR に対してカスタムライブラリをスクリーニングし、50 μM で bb3 qNOR の >50% 阻害を示す 52 のヒット化合物を得ました (図 4b)。その中で、bb3 qNOR 特異的阻害剤の 1 つである Q275 を発見しました。 Q275 は mtCcO または bo3 UqO のいずれとも交差しませんでした (図 4c)。 Q275は、哺乳類細胞の細胞呼吸や細胞生存率に影響を与えませんでした（図4d、e）。 Q275にはアロステリックな阻害モードがあることが確認されました（図4f）。さらに、bb3 qNORの対応するアロステリック部位の周囲のアミノ酸置換変異体は阻害効果にかなりの変化を示し、Q275がポケットでbb3 qNORに結合することが確認されました（図4g）。

a 低スピンヘムの周囲の立体構造は、bb3 qNOR (PDB: 6fwf) で保存されています。赤い影は、キノール結合部位とは異なるアロステリック部位を示します。 b N. meningitidis bb3 qNOR (x 軸) および E. coli bo3 UqO (y 軸) に対する 50 μM での 434 種類の化学物質のスクリーニング。 Q275 は特異的な bb3 qNOR 阻害剤であり、緑色で示されています。 c bb3 qNOR 活性に対する Q275 の用量依存的かつ特異的な阻害。 d Q275 は哺乳動物細胞の酸素消費速度に影響を与えません。各グループの N = 6 回の技術的反復を 2 つの独立した実験で再現しました。 e Q275 は、ラット心筋細胞で評価された細胞毒性を示しません。ノースカロライナ州; DMSO、PC; 1% トリトン X-100。 N = DMSO の技術的複製は 6 つ、他のグループの場合は 3 つです。再現性は 2 つの独立した実験によって確認されました。 f DMSO および 10 μM Q275 分子を使用した bb3 qNOR の動態解析。フィッティングラインは、非競合阻害モデルを使用したミカエリス・メンテン方程式を使用して計算されます。 g bb3 qNOR のアミノ酸置換の効果。 Val293、Val289、および Trp334 の位置を (a) に示します。 h 淋菌参照株 WHO F およびセフトリアキソン耐性 FC428 に対する Q275 の最小発育阻止濃度 (MIC)。 NO 条件を模倣するために亜硝酸ナトリウム (20 mM) を添加しました。データは重複した実験を表しています。 i 両菌株由来の淋菌 WHO F、FC428、および NorB 欠損の Q275 処理から 24 時間後のコロニー数。 NO 条件を模倣するために亜硝酸ナトリウム (20 mM) を添加しました。点線は接種 (5 × 105 CFU/ml) を示します。 c、f、g データは、3 回 (f、g) の独立した実験にわたる技術的反復の平均値として表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして利用できます。

最後に、我々は、セフトリアキソン（FC428）に耐性を持つ臨床的に分離された淋菌株に対する Q275 の抗菌効果をテストしました。超耐性菌である淋菌の蔓延は、深刻な世界的な健康問題となっています4。注目すべきことに、Q275は、感染性の生体内環境を模倣し、NO攻撃（免疫細胞からの攻撃）条件下でFC428および参照株（WHO F）に対して抗菌効果を実証しました（図4h）。我々は、WHO FとFC428の両方のバックグラウンドで、qNORをコードするnorB欠損株を樹立した。 NO 攻撃条件 (20 mM NaNO2) では、WT と FC428 の両方の NorB 欠損株は増殖せず、増殖阻害が qNOR を介して媒介されることがさらに裏付けられました。これらのnorB欠損株を使用して殺菌効果と静菌効果を区別するために、NaNO2への曝露後にコロニーカウントを実行し、淋菌のqNORを標的とすることが静菌性であることを発見しました（図4i）。これらの結果は、我々のアプローチが、狭い範囲の特異性を備えたオンデマンドの病原性細菌性HCOに対する特異的阻害剤を開発し、AMRに取り組む治療上の可能性があることを示唆している。

次に、阻害メカニズムに焦点を当てました。 mtCcO上のT113の結合部位は、合計4つのヘリックスに囲まれた狭いトンネルを形成しました（図1b）。 Fo(T113)-Fo(DMSO) 差分マップにより、阻害剤の結合によって引き起こされる mtCcO の構造におけるいくつかの違いが明らかになりました。プロトン経路の出口部位 (Asp50、Asp51)、サブユニット内の TM10 の Ser382 の側鎖です。 I、およびヘムaのヒドロキシファルネシルエチル基（補足図2b）。これらは、mtCcO の還元型と酸化型の間で構造変化が報告されている部位であり、T113 が mtCcO35 を還元した可能性が高まっています。この可能性をテストするために、亜ジチオン酸塩または T113 によって還元された mtCcO の特徴を分析しました。亜ジチオン酸塩によって誘導された完全な還元状態と比較して、T113 と混合した mtCcO は、ソーレーバンドの還元変化の最小限の兆候と、還元ヘムの特徴である約 600 nm の吸収スペクトルの増加を示し、T113 が還元試薬ではないことを示唆しています。 (補足図6)。したがって、我々が観察した構造変化は阻害のメカニズムを完全に説明するものではありません。

アロステリーの機構では、エフェクター結合は、立体構造アンサンブルの遷移によって機能部位であるオルソステリック部位にシグナルを伝達しますが、そのスナップショットの性質や結晶化における制約の可能性のため、構造解析で捉えることが困難なことがよくあります 36。したがって、機構的な洞察を得るために、阻害剤の有無にかかわらず mtCcO の分子動力学 (MD) シミュレーションを適用しました。全体として、阻害剤 (ホロ MD) を使用した MD シミュレーションでは、重大な構造変形は見られませんでした。注目すべきことに、阻害剤の平均軌道は、阻害剤結合ポケットを形成する4つのヘリックスのうちの1つであるサブユニットIのTM2がTM5/6の方向に曲がっていることを示しましたが、TM3はホロMDとアポMDの間で変化しませんでした（図1）。 .5a–c)。この動きは、分子酸素のチャネル、TM2/4 と TM5/6 の間に囲まれた疎水性空洞が収縮していることを示唆しています。 holo-MD は、酸素チャネルに面し、最小断面積部分を形成する Glu242 と Ile66 の間の距離が、阻害剤の存在下で狭くなることを示しました。対照的に、生成水の出口経路に面するIle312とVal287の間の距離は変化しませんでした（図5c、d）。さらに、リガンド結合 MD (Re-apo MD) 後のリガンド除去を伴う追加のシミュレーションを実行しました。 Re-apo MD は、酸素チャネルの変化は Re-apo MD 中に緩和されなかったものの、TM2 が初期のアポ構造に緩和することを実証しました。これは、TM2 に隣接する阻害剤の TM2 に対する影響が、TM2 に対する影響よりも直接的であることを示唆しています。酸素チャネル。これらのデータは、T113 が BNC への酸素のアクセスを妨げ、それによって酵素反応を阻害する可能性を示唆しました。

a アポ MD、ホロ MD、および Re-アポ MD の軌道からの代表的なスナップショットにおける TM2 および 3 の軸。軸は UCSF Chimera ツールによって計算され、円柱で表されます。ヘム a および T113 分子は緑色の棒で示されています。 b TM2 および 3 の角度の分布ヒストグラム。 c MD シミュレーションの焦点領域。酸素チャネル (赤) と水チャネル (緑) のパスは CAVER によって計算され、連続した球として表示されます。サブユニット I の TM1-6 は濃い青色で示され、サブユニット I の他のヘリックスは淡い青色で示され、mtCcO のサブユニット COX7C は赤色で示され、他のヘリックスは黄色で示されます。 d 酸素チャネルの Glu242-Ile66 間の距離と水チャネルの Ile312-Val287 間の距離の分布ヒストグラム。 (a、c) の矢印は T113 による TM2 の動きを示しています。 b と d の点線は中央値を示します。 e N62 なしの mtCcO ヘム ((i)、(iii)) および N62 ありの ((ii)、(iv)) の 441.6 nm 励起共鳴ラマンスペクトル。 mtCcO サンプルに 10 分間の暗所インキュベーションを挟んで 2 回レーザー照射しました。最初の 30 分間の照射の 0 ～ 3 分および 27 ～ 30 分でスペクトル ((1); 青) および ((2); 緑) が得られました。暗所で 10 分間インキュベートした後、2 回目の 30 分間の照射の 0 ～ 3 分と 27 ～ 30 分でスペクトル ((3) 黒) および ((4) 赤) が得られました。レーザー出力は、((i)、(iii))の場合は 1 mW、((ii)、(iv)) の場合は 0.1 mW でした。 f ストップフロー実験により、N62 は CO と CcO の結合を対照より 5 倍遅く阻害することが示されました。 440 nm での吸光度の変化は、還元された mtCcO への CO の結合に関連しています。 g 還元された野生型 bo3 UqO への CO の結合に関連する 430 nm での吸光度の変化。フィッティングラインは 1 相減衰モデルによって計算されます。データ範囲は、CcO については 4 回の反復、bo3 UqO については 3 回の反復の標準偏差として表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして利用できます。

T113 が酸素チャネルにアロステリック効果を及ぼすかどうかをテストするために、X 線結晶構造分析では評価できない構造変化を検出する高感度な方法である共鳴ラマン分光法を実行しました。 T113は自己蛍光を持っているため、その誘導体をスクリーニングし、自己蛍光がなく親和性が高いためN62を選択しました（補足図4b、c）。 N62が共結晶学で同じ結合部位に結合することを確認し（補足図4d）、T113と同様にヘム吸収に440 nm付近で小さな差を与えた（補足図4e）。以降、ラマン分光分析には N62 を使用しました。以前、可視光が mtCcO の光還元を誘導し、最初にヘム a が還元され、続いてヘム a337 が還元されることが報告されていました。図4eは、ヘムの光還元に焦点を当て、N62を使用した場合と使用しない場合のmtCcOの共鳴ラマンスペクトルを示しています。 1356/1372 cm-1 の共鳴ラマンバンドは、酸化還元状態の指標であるヘム (ヘム a およびヘム a3) の ν4 モードに割り当てられます。還元状態では 1356 cm-1、還元状態では 1372 cm-1酸化状態38． N62 を含まない対照条件では、1 mW のレーザー出力でのレーザー照射により、ヘムの光還元が実証されました。照射を停止すると、利用可能な酸素により酸化ヘムが回復し、酸化還元マーカーのバンドが逆転しました。レーザーを再照射すると、ヘムが再び減少することが実証されました（図5e(i)）。対照的に、N62 を含む mtCcO は異なる光還元挙動を示しました。 N62 では、わずか 0.1 mW の低いレーザー出力で同等のヘムの減少が観察されました。注目すべきことに、レーザー照射の中止は還元マーカーバンドを減少させず、再照射はそれのさらなる増加を示した（図５ｅ（ｉｉ））。これらのデータは、N62 が酸素による光還元ヘムの再酸化を阻害することを示しています。酸素結合をより直接的に調べるために、次に、ヘム a3 の 5 配位の還元状態を表す、酸素結合部位であるヘム a3 の 215 cm-1 の Fe-His 伸縮モード (νFe-His) を分析しました。酸素分子がヘム a3 に結合すると、215 cm-1 のバンドが消失します。 N62を含まないmtCcOは、215cm-1バンドの増加/減少サイクルを示しました（図5e（iii））。しかし、N62を含むmtCcOは、215 cm-1バンドの連続的な上昇を示しました（図5e（iv））。これは、N62がヘムa3への酸素の結合を阻害するという実験的証拠を提供します。酸素によるヘム a3 の再酸化の阻害により光還元の閾値が低下し、mtCcO 結晶の構造変化がデータ取得中の X 線誘起還元によって引き起こされたと考えられることが示されました。

酸素チャネルに対する阻害剤の効果をさらに強化するために、我々は一酸化炭素（酸素分子の代替）の二核中心へのアクセスを直接評価できるストップフロー実験を実施しました39。図５Ｆに示すように、Ｎ６２は、対照よりも５倍遅く、ＣＯとＣｃＯの結合を阻害した。したがって、酸素アクセスチャネルにおけるアロステリック阻害が mtCcO の阻害に主要な役割を果たしていると結論付けました。

mtCcO で我々が発見したアロステリーは、細菌性 HCO とその阻害剤の間でも保存されていると考えられます。この目的を達成するために、我々は、遺伝子操作可能な bo3 UqO の酸素チャネルに面するアミノ酸に単一のアミノ酸置換を作成しました。作成された変異体の中で、mtCcOのGlu242およびPhe67に対応するGlu286およびPhe112のそれほどかさばらない置換（図3cおよび5c）は、N4の阻害効果を減少させました（補足図6c）。さらに直接的な証拠を得るために、bo3 UqO を使用したストップフロー実験を実行しました。 N4 の吸光度は 400 ～ 450 nm 付近であるため、この実験では N62 を使用しました。 N62 は T113 の誘導体であり、mtCcO と bo3 UqO の両方に対する共通の阻害剤です。まず、bo3 UqOに対するN62の阻害効果も、N4と同様に酸素チャネルの変異体によって低下することを確認しました（補足図6d）。 bo3 UqO を用いたストップフロー実験では、mtCcO と同様に、阻害剤が bo3 UqO における CO 結合も遅くすることが実証されました (図 5g)。これらの多峰性解析を総合すると、我々のHCO阻害剤は、サブユニットIの膜貫通ヘリックスの構造変化によってBNCへの酸素/NO分子の侵入をアロステリックに阻害し、それによってHCO機能を阻害すると結論づけた。

独特の作用機序を持つ薬剤は、特に淋菌を含む病原体が現在利用可能なすべての抗生物質に対する耐性を獲得し、世界中に蔓延して治療不可能になる場合、AMRを克服するための抗菌薬の選択肢を拡大するために重要です40。呼吸鎖は抗生物質開発の有望な標的となっている。生命における呼吸鎖の重要性を考慮すると、副作用のリスクを最小限に抑えるためには、起立性阻害剤よりもアロステリック阻害剤の方が望ましいと考えられます。今回、我々はHCOに保存されたアロステリーと、真核生物のmtCcOにのみ見られる追加のヘリックスを同定した。このアロステリーの構造的違いにより、疾病管理予防センターの 2019 年の報告書における 5 つの緊急脅威の 1 つであるセフトリアキソン耐性淋菌に対する抗生物質を含む、2 つの異なる細菌性 HCO に対する特異的阻害剤を単離することができました3。。

この研究は概念実証であり、この化合物はまだ医薬品開発の初期段階にあります。しかし、私たちの発見は、異なる作用機序を持つ抗生物質の開発への道を開くでしょう。公表されている HCO の構造を比較すると、低スピンヘムの周囲の立体構造が細菌、酵母、植物、哺乳類のすべての HCO で非常に保存されていることが明らかになりました (補足図 3)41。私たちは救われる可能性があります。したがって、我々のアプローチは、狭い範囲の特異性で、各細菌の HCO に対してオンデマンドで特異的な阻害剤、潜在的な抗生物質を生成できます。狭スペクトル薬剤の開発は、宿主マイクロバイオームへの影響を最小限に抑え、広範な耐性を防ぐという現在の要件に沿っています42。病原性細菌は呼吸鎖に複数の末端オキシダーゼを持っていることが多いため、HCO を標的にすることは簡単ではない可能性があります。したがって、抗生物質として望ましい HCO 阻害剤は、本研究で淋菌の治療標的として qNOR を示したように、病原体が生育環境に適応するために HCO を決定的に必要とする特定の感染期を特異的に標的とするものです。併用療法として他の抗生物質と併用することもできます。我々の結果は、大腸菌に対するUqO阻害剤の効果と淋菌に対するqNOR阻害剤の効果が両方とも静菌的であることを示唆している。殺菌作用は好ましいように思えますが、静菌作用よりも殺菌作用が優れているということはほとんど文書化されていません44。臨床分野に到達するには、HCO 阻害剤のさらなる研究開発が必要です。

アロステリックポケットを囲むmtCcOの4つのヘリックスのうちの1つは、ゲノムにコードされたサブユニットCOX7Cであり、あたかもアロステリック部位を隠しているかのように表面を覆っています。私たちの系統解析により、古代のHCOのアロステリック部位が露出し、分子進化の過程で真核生物のミトコンドリアHCOに封印されていることが示されました（補足図7）。真核生物に特異的なサブユニットは、阻害剤へのアクセスから mtCcO を保護している可能性があります。あるいは、特定の時点で mtCcO 活性を負に制御する内因性阻害剤が存在している可能性があります。獲得されたサブユニットの進化的役割についてはさらなる研究が必要です。

ストップフロー実験、共鳴ラマン分光法、変異体分析を組み合わせた結果、当社の HCO 阻害剤は、サブユニット I の膜貫通ヘリックスの立体構造変化によって BNC への酸素/NO 分子の侵入をアロステリックに阻害し、それによって HCO 機能を阻害すると結論づけました。しかしながら、特にｂｏ３ＵｑＯの場合、Ｎ４が結合する部位はキノール結合部位である。キノン-bo3 UqO 構造は、N4 が基質が結合する空間を占めていることを裏付けています 45。 Asp75 と Arg71 は、キノンと同様に分子相互作用に使用されるアミノ酸 N4 と同じ 45 であり、N4 が基質結合を妨害することによって bo3 UqO を阻害することを示唆しています。これらの発見は、bo3 UqO の TM0 と TM1-3 に囲まれた空間が、我々が提案した基質結合部位とアロステリック阻害部位の両方として機能することを示唆しています。 TM0 は bo3 UqO を含むキノールオキシダーゼにのみ存在します。 bo3 UqO が基質として使用できるように、膜貫通領域の疎水性ユビキノールを効果的に安定化します。 TM0 の存在により、ユビキノールオキシダーゼファミリーは独特なものになります。 TM0は他のタイプのHCOには見出されず、TM0を持たないqNORに示されるように、我々が提案したアロステリック部位は基質結合部位とは異なります。

mtCcO に関しては、酸素侵入の阻害機構が mtCcO の T113 および N62 阻害に重要な役割を果たしていることが実証されました。ただし、bo3 UqO 上の N4 について議論した場合のように、他の阻害機構も関与している可能性があります。 mtCcO-T113結晶構造のAsp50/51とSer382の構造変化を発見しました。以下の理由から、試料調製時の光還元と放射線による還元が原因であると考えました。 (1) Asp50/51 および Ser382 の変化は、CcO 構造の還元型で見られます。ただし、T113の単純な添加ではCcOの減少は引き起こされませんでした（補足図6a、b）。 (2) ラマンデータ取得時のレーザー照射により CcO が減少した。図5eは、mtCcO阻害剤が光還元の閾値を低下させたことを示唆しています。（3）阻害剤を使用したMDシミュレーションでは、Asp50 / 51の構造変化は引き起こされませんでした（補足図6e）。しかしながら、これらの観察は、T113 の結合が Asp50/51 および Ser382 に見られる構造変化を誘導する可能性を排除するものではありませんでした。これらの残基の変化は、プロトンポンピングまたは電子移動に影響を与える可能性があります。 Asp50/51 と Ser382 は、特に mtCcO においてプロトンポンピングに必須の残基であり、吉川ら 16 が示唆するように H チャネルを形成しますが、H チャネルは mtCcO でのみ見られます。 Rich らは、H チャネルが誘電体ウェルとして機能することを示しました 17。さらに、Sharma グループは最近、Ser382 担持ドメインの構造変化が電子伝達に影響を与えることを報告しました 46。したがって、この領域の摂動は、プロトンのポンピングまたは電子の移動の阻害を引き起こす可能性があります。さらなる研究が保証されます。

100 ns の MD シミュレーションにより、mtCcO 阻害剤のアロステリック機構に対する重要な手がかりが得られました。しかし、Re-apo MD は、酸素チャネルが apo を弛緩させることを示していません。分子機構の詳細を明らかにするには、より長い MD が必要になる場合があります。

私たちのアプローチは、他の治療標的におけるアロステリックモジュレーターの発見にも応用できます。酵素は一般に、分子進化に伴って追加のドメインまたはサブユニットを獲得します22、23。生体エネルギー学における呼吸鎖は生命にとって基本的かつ不可欠であるため、HCO 以外の呼吸酵素も種間で保存され、その中心構造も保存されています。これらの呼吸酵素の分子サイズは、対応する細菌よりも真核生物の方が大きくなります。呼吸鎖は抗生物質の標的であることが証明されているため、真核生物と細菌の間の構造の境界にあるタンパク質内にアロステリーが含まれている可能性があり、抗生物質の開発につながる可能性があります。さらに、生命に必須で種間で保存されている基本的な分子は、潜在的な標的となる可能性があります。また、追加のペプチドには、コア構造の境界にポジティブアロステリックサイトが含まれる可能性があります。ヒトの機能喪失疾患に対するポジティブアロステリックモジュレーターは、治療の方向性となる可能性がある。

一般に、アロステリック部位の探索は困難であり、標的タンパク質ごとにかなりの実験作業が必要であり、他のタンパク質に適用することは困難です。埋もれた保存されたアロステリーの概念は、非常に望まれている体系的なアプローチの開発に役立ちます。タンパク質構造の数は、cryo-EM の出現と、Alphafold2 や RoseTTAfold47、48 などの構造予測の最近の進歩により、大幅に増加しました。種間のタンパク質構造を比較すると、静的構造だけでなく、MD によって生成されたアンサンブルも含めて、埋もれた保存されたアロステリックサイトの発見が加速されます。したがって、結論として、この研究は、特に異なる作用機序を持つ抗生物質について、タンパク質科学と治療法の開発に新たな道を開くことになるでしょう。

ウシ心臓チトクロム c オキシダーゼ溶液と結晶は、以前の研究で説明されているように調製されました 49。凍結する前に、結晶を最終培地中の2 mM 化合物またはDMSOで処理しました。

X線実験はSPring-8のビームラインBL26B1/B2で実施されました。回折データの処理とスケーリングは XDS50 を使用して実行されました。初期位相は、非タンパク質分子を除去した後、PDB コード 5B1A のモデルを使用して MOLREP51 によって計算されました。密度を改善し、モデルのバイアスを除去するために、Phenix52 の最大エントロピー法が実行されました。化合物ありとなしの間の差分電子密度マップの計算には、CNS53 の Fo-Fo マップ計算をリガンド省略モデルで使用しました。 COOT54を使用してリビルドを行いました。モデルは、月原富竹博士によって修正された原子パラメータを使用して、REFMAC555 および phenix.refine56 で洗練されました。モデルのバイアスを除去するために、再構築に使用されるすべての電子密度マップは、複合省略モデルを使用して計算されました。電子密度マップは複製サンプルで確認されました。リファインメント統計は表 S1 に示されています。

精製したmtCcOおよび化合物を96ウェルプレート上でアッセイ緩衝液（pH 7.4、50 mMリン酸カリウム、0.1％ウシ血清アルブミン、0.025％ 14:0 Lyso PG）中30℃で30分間インキュベートしました。酵素反応を開始するために、還元型シトクロム c (1.5 μM) を混合物に添加し、プレートリーダーを使用してプレートを 550 nm で読み取りました。 60 秒間の傾きを計算し、陰性対照としての DMSO 処理サンプルと比較することで mtCcO 活性の変化をエクスポートしました。

分光法用の mtCcO 溶液は、60 mM リン酸ナトリウム緩衝液および 0.2% n-デシル-β-d-マルトシド (pH 6.8) 中の 50 μM N62 を含むまたは含まない 15 μM mtCcO に調製され、特に指定のない限り、スペクトルは 4 °C で測定されました。。吸収スペクトルは、分光光度計 (lamda650、PerkinElmer) を備えた 3 mm パスキュベットで測定しました。スペクトルは 1 cm 相当の吸光度値で表示されました。酸化された mtCcO は空気下で測定され、亜ジチオン酸塩で還元された mtCcO は N2 下で測定されました。共鳴ラマンスペクトルは、励起波長 441.6 nm (HeCd レーザー、Kimmons) で 2000 rpm の回転セルで測定しました。ラマン散乱光は、90°散乱幾何学形状の CCD (Symphony II、Horiba) を取り付けたラマン分光計 (500M、SPEX) によって検出されました。ラマン測定用の静止酸化 mtCcO 溶液を調製し、酸素レベル 100 ppm 未満のグローブボックス (MM3-H60S、MIWA) 内のゴム隔膜で密閉された紡糸セルに移しました。使用した緩衝液とゴム隔壁を脱気し、グローブボックス内で一晩インキュベートしました。このようにして調製した試料溶液には残留酸素が少量しか含まれていないため、光還元測定においてすべてのヘム a3 がすぐに完全に酸化されることはなく、5 配位の還元型ヘム a3 画分が確実に観察されました。

モデルシステムは、全原子 MD シミュレーションを実行するために、還元されたウシ mtCcO 結晶構造 (PDB ID コード 3AG2) から構築されました。 PDB ID コード 3AG2 原子構造に存在するすべての結晶水分子が除去されました。システムの欠落している水素原子は、AmberTools 2020 の tleap プログラムで追加されました (参照: https://ambermd.org/CiteAmber.php)。タンパク質、水、イオンの Amber ff14SB 力場 57 と、脂質の Amber lipid14 力場 58 が MD シミュレーションに採用されました。 CHARMM-GUI59 を使用して、13 サブユニットのモノマー mtCcO 全体を、50% ホスファチジルコリンと 50% ホスファチジルエタノールアミンで形成された脂質二重層に浸漬しました。次に、脂質二重層を持つタンパク質を、長方形のボックス内の TIP3P 水モデルで溶媒和しました。定期的に繰り返される画像による人為的な影響を避けるために、ボックスは各タンパク質から 20 Å のマージンをあけて作成されました。金属中心とアミノ酸のパラメーターは以前の研究から得られました60。簡単に説明すると、CuA とヘム a は酸化され、ヘム a3 と CuB は還元されました。残基のプロトン化状態は静電連続体法により決定した。重要な残基のプロトン化状態は次のとおりです: ヘム a および a3 のすべてのプロピオンが脱プロトン化され、Arg438 および 439 が脱プロトン化され、Asp364 および Glu242 が脱プロトン化され、His290 および His291 はδ位でプロトン化されました。各系を対イオンで中和するために、いくつかの水分子がランダムに選択され、Na+ または Cl- イオンのセットで置き換えられました。クーロン相互作用には粒子メッシュ Ewald (PME) 法が採用されました 61。すべての MD シミュレーションは GROMACS 2019 ソフトウェアを使用して実行されました62。膜 - タンパク質 - 溶媒系全体は、アポ MD の場合は 302,004 個の原子、ホロ-MD の場合は 302,029 個の原子で構成されていました。 MD シミュレーションは、2 fs タイムステップを使用して、一定 NPT (300 K および 1 atm) アンサンブルの下で実行されました。

各システムを平衡化するために、次の処理 (a ～ c) が考慮されました。 (a) エネルギー最小化が 10,000 ステップで実行されました。 (b) 100 ps MD 平衡化は、V-rescale サーモスタット 63 を使用して 300 K、1 atm で実行されました。(c) 100 ps MD 平衡化は、Berendsen カップリング 64 を使用して 300 K、1 atm で実行されました。各スナップショットは 1 ps65 ごとに記録されました。最後に、100 ns MD シミュレーションが生産実行として一定 NPT (300 K および 1 atm) アンサンブルの下で実行され、最後の 80 ns が解析として使用されました。統計的に信頼できる軌道を取得するために、アポ構造またはホロ構造に対して異なる初速度で 3 回の実行を実行しました。

最初のグループでは、ソフトウェアを使用して、2D フィンガープリント (MACCS キー、ECFP4、FCFP4、および GpiDAPH3) と 3D 形状メトリクス (ComboScore) に基づいて、4 つの mtCcO 阻害剤と 8,000 万の市販化合物のそれぞれの間のタニモト係数を計算しました。 Pipeline Pilot (BIOVIA、Dassault Systèmes)、MOE (Chemical Computing Group)、および ROCS (OpenEye Scientific Software)。高いタニモト係数値を示す化合物を ECFP4 フィンガープリントによってクラスター化し、各クラスターの中心にある化合物を酵素アッセイ用に選択しました。 2 番目のグループでは、Schrödinger suite 2016-1 (Schrödinger, LLC) の調製ウィザードを使用して mtCcO/T113 複合体構造を適切に調製し、ドッキングプロトコルの受容体グリッド生成を実行しました。 Glide 7.0 を使用して、8,000 万の市販化合物を mtCcO に対して分子ドッキングしました。複合体内で T113 と同じ空間を共有する Glide スコアに基づいて選択された化合物を ECFP4 フィンガープリントによってクラスター化し、各クラスターの中心にある化合物を酵素アッセイ用に選択しました。最終的に 434 個の化合物が選択され、購入されました。

サブユニット II 上のカルボキシル末端 His タグを持つ bo3 UqO をコードするプラスミドは、Gennis 研究所から寄贈されました 66。 bo3 UqO は前述の方法に基づいて精製されました 67。簡単に説明すると、プラスミドを C43 (DE3) Δcyo E. coli 株に形質転換し、細胞を M63 培地で増殖させました。 bo3 UqO は 1% n-ドデシル-β-d-マルトシド (C12M) で可溶化し、TALON 樹脂、Super-Q 樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィーで精製した後、25 mM Tris-HCl、200 を含むバッファーに保存しました。 mM NaCl、および 0.02% C12M (pH 7.5) 濃度 10 ～ 15 mg/mL。

精製した大腸菌 bo3 UqO をリポソーム（卵黄ホスファチジルコリン：大腸菌極性脂質 = 3:1）に再構成しました。メスの BALB/c マウスを、50 μg のリポ多糖を含む 0.1 mg 用量の再構成 bo3 UqO で 7 日間隔で 5 回免疫しました。免疫化マウスの脾臓から単細胞懸濁液を調製し、従来のポリエチレングリコール (PEG) 法 68 を使用して、細胞を P3U1 骨髄腫細胞と融合させました。抗体のスクリーニングは、リポソーム酵素免疫測定法 (L-ELISA)、変性 ELISA (D-ELISA)、およびサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の 3 つの方法で実施されました69。 L-ELISA では、精製した bo3 UqO をビオチニル PE を含むリポソームに再構成し、ImMobility Streptavidin プレート (Nunc) に固定しました。精製された bo3 UqO と安定な複合体を形成する高親和性抗体は、Superdex 200 5/150 カラム (GE Healthcare) 上の SEC によって選択されました。大腸菌 bo3 UqO の天然立体構造を認識する抗体を、SDS 変性大腸菌 bo3 UqO を用いた D-ELISA によってアッセイしました。選択された３つのクローンを限界希釈培養法により単離し、抗ｂｏ３ＵｑＯ抗体を産生するモノクローナルハイブリドーマ細胞株を樹立した。抗 bo3 UqO モノクローナル抗体の Fab フラグメントを記載どおりに調製しました 69。精製した bo3 UqO タンパク質を Fab フラグメントと 4 °C で 24 時間混合し、bo3 UqO – Fab 複合体を SEC で精製した後、N4 とインキュベートしました。 3 つのクローンをクライオ EM でテストし、構造決定のために 1 つを選択しました。

精製した UqO と化合物を 96 ウェルプレート上で、アッセイ緩衝液 (pH 7.4、50 mM リン酸カリウム、1 mM エチレンジアミン-N',N',N',N'-四酢酸 (EDTA) 中で 25 °C で 60 分間インキュベートしました) )、0.1% ウシ血清アルブミン、0.15% C12M)。酵素反応を開始するために、還元された 40 μM の UQ-1 を混合物に添加し、その後、プレートリーダーを使用してプレートを 278 nm で読み取りました。傾きが計算され、陰性対照としての DMSO 処理サンプルと比較することで酵素活性の変化がエクスポートされました。

3 µL のサンプルをグロー放電 Quantifoil グリッド (R1.2/R1.3 300 メッシュ、銅) に適用し、湿度 100%、8 °C でブロットし、Vitrobot MkIV を使用して液体エタンに浸しました。 Cryo-EM 分析は、最初に、KEK の Falcon3 検出器を備えた Talos Arctica 顕微鏡を 200 kV で使用して実行されました。データ収集は、理化学研究所 SPring-8 の計数モードの Gatan K2 Summit 検出器を備えた Glacios 顕微鏡を使用して実行されました。動画は、45,000 倍の倍率で、40 フレームにわたって Å2 あたり 50.0 電子の蓄積線量で取得されました。ピクセルサイズは０．８８９Åであった。データは SerialEM ソフトウェア 70 を用いてビームイメージシフト法により自動取得した。

Cryo-EM データ処理は RELION 3.171 を使用して実行されました。 RAW ムービースタックは、RELION 独自の実装の MotionCor272 を使用してモーション補正されました。 CTF パラメーターは、CTFFIND4 プログラムを使用して決定されました73。 UqO (Glacios からの 12,388 個のムービースタック) と UqO/複合複合体 (Glacios からの 7173 個のムービースタック) のデータ処理ワークフローをそれぞれ図 S3A ～ H にまとめます。最終的な解像度は、2 つの独立して洗練されたハーフマップ間のゴールドスタンダードフーリエシェル相関 (FSC) によって推定されました (FSC = 0.143)。 EM マップに対するモデル構築では、MOE プログラムスイート (MOLSIS Inc.) を使用した相同性モデリングによって初期モデルを生成し、Chimera74 を使用して最終マップにドッキングしました。その後、モデルは COOT プログラム 54 を使用して手動で改良されました。 Phenix プログラムの実空間精密化は、デフォルト 52 から修正されたヘムの原子パラメーターを使用して実行されました。モデルパラメータとクライオEMマップ統計の概要を表S2に示します。

大腸菌をLB培地中で一晩増殖させ、OD600が0.0132になるまで希釈した。 5μLの細胞を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、128μg/mLの濃度の化合物または100μLのLB培地で2倍段階希釈して処理した。次いで、プレートを振盪せずに37℃で24時間インキュベートし、プレートリーダーを使用して600nmで読み取って細胞増殖を定量した。 C43 (DE3) 染色および C43 (DE3) Δcyo は中谷良雄博士から提供され、それぞれ野生株および bo3 UqO ノックアウト株として使用されました。 C43 (DE3) ΔcydΔappx は Robert Gennis 博士によって提供され、bo3 UqO 依存性株に使用されました。 32 μg/ml の N4 は上記のアッセイで増殖阻害を示したので、32、128 μg/ml の N4 で時間および濃度に依存する生存率アッセイを実施しました。接種材料は約 1 × 105 CFU/ml で作成され、振盪せずに 37 °C でインキュベートされました。生存コロニーを一定時間(12、24、48、および72時間)にカウントした。

Neisseria meningitidis bb3 qNOR は城研究室から提供されました。発現および精製は、修正を加えて以前に報告されたとおりに実行されました34。

抗菌薬感受性試験には、淋菌参照株 WHO F75 およびセフトリアキソン耐性 FC42876 を使用しました。 N. gonorrhoeae は GW 培地中、5% CO2、37 °C で振盪せずに培養されました 77。培地の調製は株式会社機能性ペプチド研究所に委託し、マイクロブロス希釈MIC法を用いて、各菌株に対するQ275のin vitro抗菌活性を定量測定した。増殖を妨げた抗生物質の最低濃度をMICと解釈しました。亜硝酸ナトリウム (20 mM) を培地に添加して、NO 攻撃条件 (免疫細胞からの攻撃) を模倣しました。コロニー数アッセイでは、約 5 × 105 CFU/ml の接種材料を調製し、振盪せずに 37 °C で 24 時間インキュベートしました。生き残ったコロニーを数えた。

淋菌変異体は、以前に記載されたように構築された78。簡単に説明すると、N. gonorrhoeaeのnorB欠損変異体を構築するために、norB遺伝子を含むN. gonorrhoeae FA1090染色体DNAからの4.3 kb DNA断片を、プライマーnorB-1およびnorB-2を用いてPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼにより増幅しました(タカラバイオ）を用いて、ｐＭＷ１１９ベクター（４．２ｋｂ）（日本遺伝子）のＳｍａＩサイトにクローニングし、ｐＨＴ１７２９（８．５ｋｂ）を構築した。 pHT1729の6.5kb DNA領域をプライマーnorB-3およびnorB-4を用いてPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼにより増幅し、カナマイシン耐性遺伝子(kan)と連結してpHT1739を構築した。 NorB構造遺伝子がkan遺伝子に置換されたnorB対立遺伝子を含む3kbのDNA断片を、pHT1739由来のプライマーnorB-1およびnorB-2で増幅し、淋菌株およびカナマイシン耐性クローンを形質転換した。選択され、norB 欠損変異体が生じます。使用したプライマーは、

NorB-1TCGAGCTCGGTACCCGATGTAGAACTCTTTATCCACTTTCGGCAG

NorB-2CTCTAGAGGATCCCCAGGCGGGCAGCCGCCGTTTCCAACGGTTTG

NorB-3GGGAAAACCCTGGCGGTTTTAGCCTGAAAATGGAAACCG

NorB-4CATAGCTGTTTCCTGTTTGAGAGCTCCTTTTAATAAATC

完全還元酵素を調製するには、DMSO または 200 μM N62 と混合した酵素溶液 (1 μM の mtCcO または 0.5 μM bo3 UqO) を減圧下および N2 雰囲気下で交互にインキュベートし、次に亜ジチオン酸により還元しました。 CO 溶液は、mtCcO の場合は真空圧と 20% CO 雰囲気下、bo3 UqO の場合は 100% CO 雰囲気下で交互にインキュベートすることによって調製されました。還元酵素への CO の結合を調べるために、等量の還元酵素溶液と CO 溶液をストップフロー分光計で 4 °C で混合しました。

XFe96 細胞外フラックスアナライザー (Agilent) を使用して、酸素消費率 (OCR) を測定しました。測定の前日に、マウス C2C12 細胞を XFe96 培養マイクロプレートに播種しました (1 ウェルあたり 1.0 × 104 細胞)。各ウェルの OCR を、基本条件下、2 mM l-グルタミンおよび 1 mM ピルビン酸ナトリウムを含む非緩衝 DMEM 中で、1 μM オリゴマイシン A (Oligo A)、2 μM フルオロカルボニルシアン化フェニルヒドラゾン (FCCP)、および 0.5 μM に応答して測定しました。ロテノン + 0.5 μM アンチマイシン A (Anti/Rote)。 ATP 産生の OCR は、Mito Stress Test Report Generator を使用して基礎 OCR - オリゴ A OCR として計算されました。

マイクロプレート LDH アッセイ (細胞毒性 LDH アッセイキット、同仁堂、CK12) を使用して、Q275 の細胞毒性を測定しました。使用した哺乳動物細胞は、10% ウシ胎児血清を添加した DMEM 中で培養したラット新生児心筋細胞でした。細胞を組織培養処理した 96 ウェル平底プレートに播種し、37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。２４時間後、培地を吸引し、試験化合物を含む新鮮な培地と交換した。 24 時間のインキュベーション後、製造業者のガイダンスに従って上清中の LDH 活性を評価しました。

データベースからアミノ酸配列を取得する際には、結晶構造が解明されPDBに登録されている配列を優先的に選択した（PDB IDを表示）。その他のアミノ酸配列については、既報41に従い、HCO酵素A型、B型、C型、NOR型から分類群内の代表的なアミノ酸配列を選択した。これらは次のように示されました: Bos taurus (5B1A_1)、Homo sapiens (5Z62_1)、Saccharomyces cerevisiae (6T15_11)、Pseudomonas stutzeri (3MK7_1)、Rhodobacter capsulatus (6XKX_4)、Thermus Thermophilus (A2: 2YEV_1、ba3: 1EHK_1)、大腸菌（ 1FFT_1)、Bacillus subtilis (bo3: 6KOB_1、aa3: P24010)、Mus musculus (BBA31677)、Aquifex (A1: O67935、A2: O67937)、Rhodothermus marinus (CAC08532)、Paracoccus denitrificans (P08305)、Yersinia pesこれ (WP042593520)、緑膿菌 (MXH36788)、スノッドグラッセラアルビ (WP_100091491)、リケッチアレス菌 (MBB19300)、ラクリミスポラインドリス (VDG67555)、ハロバクテリウム (WP_010902450)、ナトロノモナスファラオニス (CAA71525) ）、Geobacillus stearothermophilus (3AYG)、および Pseudomonas aeraginosa (3O0R)。

N末端をトリミングしてアラインメントの全長を揃えた後、Clustal Omega v1.2.1を使用して複数のアミノ酸配列アラインメントを実行しました79。デフォルトのパラメーターが使用され、金属配位子や触媒チロシン残基など、HCO のプロトン経路 (プロトンチャネル) に不可欠な領域の保存が視覚的に確認されました。隣接結合 (NJ) ツリーは、PhyML v2016011581 を使用し、次のパラメーターを使用して BioNJ アルゴリズム 80 で推論されました: 1000 のブートストラップ、100 のシード、および複数の置換の補正。マジョリティコンセンサスツリーは Dendrscope v3.7582 で作成され、視覚化されました。

図5f、gのSDの分析を除いて、統計は適用されませんでした。実験は少なくとも2回繰り返され、その再現性が確認されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。クライオ EM マップは、アクセッションコード EMD-33293 (apo-bo3 UqO) および EMD-33294 (holo-bo3 UqO) で電子顕微鏡データバンク (EMDB) に寄託されています。座標は、アクセッションコード 7XMA (apo-mtCcO)、7XMB (holo-mtCcO)、7XMC (apo-bo3 UqO)、7XMD (holo-bo3 UqO) で Protein Data Bank (PDB) に登録されています。この研究で使用されている以前に公開されたアクセッションコードは 5B1A で、X 線回折実験の初期位相計算に使用されました。 MDシミュレーションには3AG2を使用しました。補足図7、5Z62、5B1A、6GIQ、6KOB、6WTI、1QLE、2YEV、1EHK、6XKW、5DJQ、3AYG、3O0Rの場合。図の基礎となるソースデータ。 2B ～ E、3E、4B ～ I、5B、D、F、G、S1A ～ C、S4A ～ D、S5D、H、J、S6A ～ D がソースデータファイルとして提供されます。ソースデータはこの文書で提供されます。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35600-y

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何よりもまず、このプロジェクトに関する洞察力に富んだアドバイスと議論をしていただいた月原富武博士と吉川真也博士に著者全員に深く感謝いたします。タンパク質の調製については鴎外明子氏に多大なご協力をいただきました。研究支援には小林聡美さん、稲垣香奈美さん、新宮恵子さん、祇園聡美さん。秘書補佐として、岡田優子氏、川崎久恵氏、黒川由佳子氏。 SPring-8 BL26 でのデータ取得にご協力いただいた中村有紀博士。青山博博士にはX線実験用の結晶準備にご協力いただきました。クライオEM単粒子分析のご指導には、横山武志博士、内窪知美博士、白水美香子博士、安達成彦博士と川崎正人博士は、大腸菌 bo3 オキシダーゼ調製物のクライオ EM データ取得のための初期スクリーニング (BINDS 1721 に基づく)。 Robert Gennis 博士と Sangjin Hon 博士は大腸菌株と大腸菌 bo3 オキシダーゼ構築物を提供してくれました。大腸菌株を提供していただいた中谷良雄博士。 Ken Daniel Inaoka 博士と喜多潔博士は、大腸菌株と bo3 タンパク質の調製に関するアドバイスを提供していただきました。 MD シミュレーションの準備については、Vivek Sharma 博士に協力していただきました。 bo3構造解析については杉本博司博士にアドバイスをいただきました。望月直樹博士、菊池和博士、福井肇博士が原稿へのコメント、James Pearson博士が英語の編集に協力してくれました。新谷Cさんにフィギュア制作のアドバイスをいただきました。本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）創薬・ライフサイエンス研究支援基盤事業（革新的創薬・ライフサイエンス研究支援基盤（BINDS））、JP19am0101113、JP21am0101070、JP20am0101071の支援を受けました。、JP21am0101082、JP20am0101109、JP20am0101083（サポート番号 1096、1099、1721、2161、2310、および 2357）。放射光実験は、高輝度光科学研究センター（JASRI）の承認を得てSPring-8で実施されました（課題番号：2016A2529、2016B2711、2017A2555、2017B2721、2018A2721、2021B2523、2022A2713）。この研究は、科学技術振興機構-進化科学技術基盤研究(CREST)からの助成金、JPMJCR14M2からST AMEDへの助成金番号JP19im0210617、JP21ek0109499、およびYShintaniへのJP22fk0108632からの資金提供によって支援された。 JP21fk0108605 日本学術振興会科学研究費補助金助成番号 ST 21H02914、YN 21K15443、MK 19H05784、KK 20K03794 革新的研究「バイオメタル」 Sciences」（助成番号 20H05497 が Y.Shigeta に付与）。

Hideki Shigematsu

現在の住所：高輝度光科学研究センター SPring-8 構造生物学部門、兵庫県佐用市

These authors contributed equally: Sachiko Yanagisawa, Rikuri Morita.

国立循環器病研究センター分子薬理学部（大阪府吹田市）

Yuya Nishida, Chisa Nakabayashi, Takemasa Nagao, Tasneem Qaqorh, Yusuke Takahashi, Satoru Yamazaki & Yasunori Shintani

大阪大学大学院生命機能研究科医生化学教室（大阪府吹田市）

Yuya Nishida, Takashi Iwamoto, Chisa Nakabayashi, Hisakazu Kato, Tasneem Qaqorh, Seiji Takashima & Yasunori Shintani

兵庫県立大学大学院理学研究科（兵庫県）

Sachiko Yanagisawa, Kyoko Shinzawa-Itoh, Waka Matsumura, Kazumasa Muramoto, Yoshitsugu Shiro & Minoru Kubo

筑波大学計算科学研究センター（茨城県つくば市）

Rikuri Morita, Ryuhei Harada & Yasuteru Shigeta

RIKEN SPring-8 Center, 1-1-1 Kouto, Sayo, Hyogo, Japan

Hideki Shigematsu, Chai Gopalasingam & Takehiko Tosha

理化学研究所生命機能科学研究センター、神奈川県横浜市

Hitomi Yuki & Teruki Honma

千葉大学大学院理学研究科化学専攻（千葉県稲毛市）

Satoshi Ogasawara & Takeshi Murata

国立感染症研究所細菌第一部門

Ken Shimuta, Hideyuki Takahashi, Yukihiro Akeda & Makoto Ohnishi

国立感染症研究所抗菌薬耐性研究センター（東京）

Ken Shimuta

神奈川工科大学基礎教育総合学習センター（神奈川県厚木市）

Katsumasa Kamiya

高輝度光科学研究センタータンパク質結晶解析部門 SPring-8（兵庫県佐用市）

Nobuhiro Mizuno & Takashi Kumasaka

東邦大学医学部微生物感染症教室

Yoshikazu Ishii

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

新谷祐樹氏がこのプロジェクトを発案し、mtCcO阻害剤のスクリーニングを実施しました。新谷裕司とYNは実験戦略を設計し、データを分析しました。 YN は、X 線結晶構造解析、クライオ EM 単粒子分析、インシリコ化合物スクリーニング、および生化学実験のほとんどを実施しました。柳沢は共鳴ラマン分光実験を実施し、WM でデータ解析を行い、MKRM は KK、RH、HY、YN、Y.Shigeta と MD シミュレーションを実施し、データを解析しました。 HS はクライオ EM データ収集を実行し、データ分析を支援しました。 NM と TK は結晶データ収集に貢献し、X 線構造解析を支援しました。 KSI は、プロジェクト全体にわたって精製ウシ mtCcO および mtCcO 結晶を提供しました。 YN は THSO の監督の下で HY を使用してインシリコ化合物スクリーニングを実施し、TM は bo3 オキシダーゼのクライオ EM 分析用のモノクローナル抗体を生成しました。 KS、HT、YA、および MO は、N. gonorrhoeae 株を提供し、MIC 測定を実行しました。 YI は淋菌の実験を分析し、アドバイスを提供しました。 TI は bo3 生化学実験を実施しました。 CN は髄膜炎菌 bb3 qNOR 生化学実験を実施しました。 HKはXFe96 Fluxanalyserを使用してOCR測定を行いました。 S.yamazaki、TN、TQ、YT は、系統解析と図の作成を含むデータ解析を実行しました。 CG、KM、TT、および Y.Shiro は、bb3 qNOR 酵素、発現構築物、および qNOR の実験設定を提供しました。新谷裕也、YN が原稿を作成しました。 ST は元の原稿の改訂を支援し、資金を獲得しました。著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

Correspondence to Yasunori Shintani.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

西田裕也、柳沢伸、森田良他ミトコンドリアのヘム銅オキシダーゼからの保存されたアロステリーの構造の違いに基づく抗生物質の同定。 Nat Commun 13、7591 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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受信日: 2022 年 5 月 15 日

受理日: 2022 年 11 月 7 日

公開日: 2022 年 12 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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