屋外保護用蚊よけクリームの製造と評価

Scientific Reports volume 12、記事番号: 2180 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

デング熱、マラリア、チクングニア熱などの蚊が媒介する感染症は厄介で、人々に深刻な不快感を引き起こす可能性があります。合成ピレスロイド、N,N-ジエチル-3-メチルベンズアミド (DEET)、N,N-ジエチルフェニルアセトアミド (DEPA)、および N,N-ジエチルベンズアミド (DEBA) ベースの蚊よけ剤には、不快な副作用と毒性があるため、当社では、クローブ油、シトロネラ油、レモングラス油を使用したエッセンシャルオイル（EO）ベースの蚊よけクリーム（EO-MRC）を開発しました。続いて、EO-MRC の製剤の特性評価、生物有効性、および安全性の研究が実施されました。蚊の頭部における抗OBP2AおよびTRPV1タンパク質の発現をウェスタンブロッティングによって研究した。特定のタンパク質についてはインシリコスクリーニングも実施した。 FT-IR 研究により、EO-MRC で使用される EO と賦形剤の化学的適合性が確認されました。最良の EO とその混合物の熱挙動は、熱重量分析 (TGA) によって特徴付けられました。 GC-MS 検査により、EO に存在するさまざまな化学成分が明らかになりました。 EO-MRC の有効性は、12% N,N-ジエチルベンズアミド (DEBA) ベースの市販クリーム (DBMC) と相関していました。 EO-MRC の完全保護時間 (CPT) は 228 分と測定されました。 L-132 細胞株に対する細胞毒性研究により、吸入時の EO-MRC の非毒性の性質が確認されました。急性皮膚刺激性研究、急性皮膚用量毒性研究、および急性眼刺激性研究により、EO-MRC の非毒性の性質が明らかになりました。ダニオ・レリオに関する非標的毒性研究により、EO-MRC が水生非標的動物に対してより安全であることが確認されました。トランスフルトリン (TNSF) に曝露された Wistar ラットでは、アセチルコリンエステラーゼ (AChE) 濃度の減少が観察されました。一方、EO-MRC は曝露された動物の AChE 濃度を変化させなかった。ウェスタンブロッティングの結果により、TNSF に曝露された蚊において抗 OBP2A および TRPV1 タンパク質が阻害されることが確認されました。 EO-MRCに曝露された蚊は、対照群と同様の抗OBP2AおよびTRPV1の発現パターンを示しました。インシリコ研究により、同定された EO の 8 つの化合物が、開発製品の全体的な忌避特性において重要な役割を果たしていることが明らかになりました。この研究では、EO-MRC の蚊よけ活性が強調されており、これは野外条件下で蚊から身を守るための既存の合成忌避剤に代わる、効果的で環境に優しく、より安全な代替品となる可能性があります。

蚊は、マラリア、フィラリア症、デング熱、チクングニア熱、西ナイル熱、黄熱病、ジカ熱などのウイルス性疾患を含むいくつかの熱帯病の主要な媒介者です1、2、3、4。ネッタイシマカ (L.) およびヒトスジシマカ (Skuse) によって広がるデング熱は、大都市における人間の住居と密接に関連しています 5、6、7。蚊が媒介する感染症は、長期駐在者、旅行者、海外、特に熱帯および亜熱帯地域に派遣されている部隊の間で病気を引き起こす主な原因であることが記録されています8。第二次世界大戦、朝鮮戦争、ベトナム戦争中に西アフリカ、北アフリカ、南太平洋、中国・ビルマ・インド国境のマラリア流行地域に派遣された際に、米国軍と外国軍の間で大小さまざまな流行が記録されている。衝突9、10、11。

残念ながら、蚊が媒介するほとんどの病気にはワクチンも特別な治療法もありません12、13。したがって、この病気が常在している国の国民には、主に適切な衣服を着用し、露出した体の部分に局所忌避剤を塗布することによって、蚊に刺されないようにすることが強く推奨されています14、15、16。屋内空間での蚊刺されの予防は、世界保健機関 (WHO) の主力推奨である長期持続型殺虫ネット (LLIN) と屋内残留スプレー (IRS) を利用することで実現できます。蚊よけ電気気化器配合物は、屋内エリアの蚊の密度を減らすのに効果的です。屋外条件で蚊に刺されないようにするには、通常、クリーム、ジェル、ローションの形の忌避剤を露出した皮膚に塗布します17。局所忌避剤は低揮発性化合物である傾向があり 18 、皮膚に蒸気バリアを提供するか、周囲の空気中にゆっくりと蒸発して節足動物を追い払います 19,20。隙間風や宿主の手足の動きによって生じる対流により、露出した皮膚上の蒸気が減少する可能性があります18。高沸点の忌避剤化合物は蒸発速度が不十分なため、局所製剤の調製には適していませんが、沸点の低い成分は急速かつ容易に消散します21。 N,N-ジエチル-3-メチルベンズアミド (DEET)、N,N-ジエチルフェニルアセトアミド (DEPA)、フタル酸ジメチル (DMP)、N,N-ジエチルベンズアミド (DEBA) およびアレスリンは、ほとんどの市販の蚊に使用されています。忌避剤配合物 11,22 は難分解性の合成化学物質であり、非生分解性です 23。環境への曝露量が増えると、生態系が妨げられる可能性があります23、24、25。 DEET は眼鏡や腕時計などのプラスチックを溶解する可能性があります。強い臭いがあり、油っぽさや灼熱感を引き起こし、特に高用量で使用すると不快感を引き起こすことさえあります26。さらに、これらの合成忌避剤の中で、耐性の発現、副作用、非標的生物に対する毒性、および生態学的懸念に関連する新たな問題が深刻な懸念を引き起こしている27。したがって、ユーザーは代替有効成分を含む忌避剤を好みます28。

ハーブエッセンシャルオイル（EO）には、殺虫性、忌避性、抑止力のあるさまざまな化学成分が含まれています29。 EO に存在するさまざまな化学組成は、局所蚊よけ製剤の有効性に寄与します。研究によれば、EO は DEET とほぼ同じ効果がある可能性があります 29,30,31。米国疾病管理予防センターは、昆虫に対する効果があるため、DEET の代替品としてレモンとユーカリの油を推奨しています 32。環境保護庁 (EPA)、米国 (US)、世界保健機関 (WHO) などの国際機関、およびその他の国は、アクセシビリティ、可用性、信頼性、経済的、低コストの観点から、多様な用途のために複数の EO を承認しました。複雑な化学を使用したリスク評価であり、連邦登録要件の対象ではありません27,33。多くの天然 EO ベースの製品が防虫剤として使用されています。しかし、植物製品は安全で効果的な局所用昆虫忌避剤として登録されています 34 が、そのアレルギー誘発性、変異原性、遺伝毒性、および完全な保護期間には依然として疑問があります。屋外で保護するための効果的で安全で環境に優しい蚊よけの局所製剤に関する広範な研究が、保護時間を延長して徐々に増加しています35。そこで、本研究では、ヒトスジシマカ蚊に対する忌避活性について 14 種類の EO をスクリーニングし、EO の最適なブレンドを利用した EO ベースの持続性の高い蚊よけクリーム (EO-MRC) 製剤を開発しました。シトロネラ油、クローブ油、レモングラス油。 EO-MRC の特性評価、有効性、安全性および毒性の研究は、Silico 分子ドッキング研究を使用して実施され、標的部位に対する EO 成分の結合親和性が要約されました。また、蚊の頭部における抗OBP2AおよびTRPV1抗体の発現をウェスタンブロッティングにより研究しました。これは、宿主の露出した皮膚から蚊を撃退するのに重要な役割を果たす可能性があります。要約すると、私たちの研究の主な目的は、屋外保護用の毒性を軽減した蚊よけ用の EO ベースの局所クリーム製剤を開発し、特性評価することです。

14 個の EO の蚊忌避率のパーセンテージにより、ヒトスジシマカ (Ae. Albopictus) に対する有効性が明らかになりました。しかし、K&D モジュールバイオアッセイでは、シトロネラ油 (95.83%)、クローブ油 (91.66%)、ラベンダー油 (86.95%)、レモングラス油 (95.83%) で最大の反応が明らかでした。レモングラス油とシトロネラ油は最大の忌避効果を示しましたが、バジル油は最低の忌避効果を示しました (29.16%)。この研究では、14 種類のエッセンシャルオイルの中から最も優れた 4 種類のオイルが、K&D モジュールの下で蚊に対する相乗効果についてさらに評価されました。クローブ油、シトロネラ油、およびレモングラス油のブレンドは最大の忌避特性（96％）を示しましたが、レモングラス油、ラベンダー油、およびクローブ油のブレンドは最小の反応（80％）を示しました。 14 種類の EO と最高のオイルのブレンドのさまざまな濃度の忌避率とその ED50 および ED95 を表 1 に示します。

EO-MRC で使用される EO と賦形剤の化学的適合性は、FT-IR 分光法によって評価されました。分析物のFT-IRスペクトルは、それぞれ補足図S1に示されています。

シトロネラ油は、1,2-二置換アルカンおよびアルデヒド基の存在によると考えられる C-H 屈曲に関して 791/cm、1380/cm、および 1460/cm で特徴的なピークを示しました。 1260/cm のピークはアルキルアリールエーテルの存在による可能性があり、1666/cm および 1714/cm の別のピークはα、β-不飽和エステル、共役ケトンの存在による可能性があります。 1844/cm および 2908/cm のピークはアルカンの存在による可能性があり、3425/cm の別の特徴的なピークはアルコール基に対応します。 C=C 曲げのピークは 990/cm。 C-O ストレッチの場合は 1260/cm、 C=O ストレッチでは 1714/cm および 1666/cm。 2844/cm および 2908/cm C-H 伸縮。 O-H 延伸ではそれぞれ 3425/cm。

クローブ油は 752/cm で C-H 曲げのピークを示しました。 S=O ストレッチの場合は 1308/cm。 C=O 延伸の場合は 1714/cm、 C-H 伸縮の場合は 2932/cm、 O-H 延伸ではそれぞれ 3472/cm。

レモングラス油は、C-H 曲げに関して 791/cm でピークを示しました。 S=O ストレッチの場合は 1030/cm。 S=O ストレッチの場合は 1284/cm。 1515/cm N-O ストレッチ。 C=C ストレッチの場合は 1610/cm。 C=O 延伸の場合は 1746/cm。 C-H 伸びはそれぞれ 2932/cm。

ミリスチン酸グリセロールは、C-H 曲げに関して 728/cm および 1465/cm でピークを示しました。 C-O 伸縮の場合は 1181/cm、 C=O 延伸の場合は 1730/cm、 C-H 伸縮の場合は 2844/cm、2940/cm、NH-H 伸縮の場合はそれぞれ 3322/cm。

セチルアルコールは CH 曲げに対して 735/cm と 1465/cm で鋭いピークを示しました。 C-O 伸縮では 1069/cm。これは第一級アルコールの存在による可能性があります。 C-H 伸縮の 2836/cm および 2908/cm は、アルカンの存在による可能性があります。 O-H 伸縮の場合は 3234/cm。 NH-H 延伸ではそれぞれ 3337/cm。

ステアリン酸は、CH 曲げに関して 754/cm でピークを示しました。 C-O 伸縮の場合は 1284/cm。 C=O 延伸の場合は 1730/cm、 C-H 伸縮の場合は 2971/cm、O-H 伸縮の場合はそれぞれ 3449/cm。

バニリンは 735/cm で C-H 屈曲のピークを示しましたが、これはいくつかの一置換官能基によるものと考えられます。 C-O 伸縮の 1260/cm は、芳香族エステル基の存在による可能性があります。 1515/cm N-O 伸縮で別のピーク。 C=C ストレッチの場合は 1595/cm および 1658/cm。 O-H 延伸ではそれぞれ 3218/cm。

EDTA は C-H 曲げに関して 776/cm でピークを示しました。 C=C 曲げの場合は 995/cm。 C-O 伸縮の場合は 1269/cm。 S=O ストレッチの場合は 1412/cm。 NH-H 曲げの場合は 1595/cm。 O-H 延伸ではそれぞれ 3218/cm。

メチルパラベンは、C=C 曲げに関して 960/cm でピークを示しました。 C-H 曲げの場合は 1465/cm。 C=O 延伸の場合は 1730/cm、 C-H 伸縮はそれぞれ 2916/cm と 3281/cm。

安息香酸ナトリウムは、C-H 曲げに関して 831/cm でピークを示しました。 C-O 伸縮では 1061/cm。これは第一級アルコールの存在による可能性があります。 O-H 曲げの場合は 1412/cm。 N-O 伸縮の場合は 1547/cm、 C=C ストレッチの場合は 1603/cm。 C-H 伸縮の場合は 3027/cm および 3059/cm。 O-H 延伸ではそれぞれ 3624/cm。

軽流動パラフィンは O-H 曲げのピークを 1388/cm に示しました。 C-H 曲げの場合は 1460/cm。それぞれ 2852/cm と 2955/cm の C-H 伸縮。

ミリスチン酸イソプロピルは、C-O 伸縮のピークを 1093/cm に示しました。 O-H 曲げの場合は 1380/cm。 C-H 曲げの場合は 1467/cm。 C=O ストレッチでは 1738/cm。 C-H 伸縮の場合は 2860/cm および 2923/cm。 O-H 延伸ではそれぞれ 3457/cm。

ジメチコンは、C-O 伸縮のピークを 1061/cm に示しました。 C-O ストレッチの場合は 1260/cm、 O-H 曲げの場合は 1412/cm。 C-H 曲げの場合は 1929/cm。 C-H 伸縮はそれぞれ 2916/cm と 2971/cm。

ビタミン E は C-H 曲げの 743/cm でピークを示しました。 C=O 延伸の場合は 1770/cm、 C-H 伸縮の場合は 2868/cm、 O-H 延伸ではそれぞれ 3504/cm。

ローズマリー油は、C=C 曲げで 982/cm、C-H 曲げで 1465/cm、C=O 伸縮で 1750/cm、C-H 伸縮で 2923/cm でそれぞれピークを示しました。

ポリエチレングリコールは、C-O 伸縮のピークを 1308/cm に示しました。 C-H 曲げの場合は 1475/cm。 C=O 伸縮では 1714/cm、C-H 伸縮ではそれぞれ 2844/cm と 2927/cm。

Tween 20 は C-O 伸縮のピークを 1117/cm に示しました。 C=O 延伸の場合は 1722/cm、 C-H 伸縮はそれぞれ 2876/cm と 2916/cm。

グリセロールは、二級アルコールの存在による可能性のある C-O 伸縮の 1110/cm のピークを示し、O-H 曲げの 1420/cm の特徴的なピークは、それぞれアルコール基に対応すると考えられます。

プロピルパラベンは、C=C 曲げに関して 960/cm でピークを示しました。 C-O 伸縮の場合は 1269/cm。 O-H 曲げの場合は 1436/cm。 C=O 延伸の場合は 1690/cm、 C-H 曲げでは 1937/cm、C-H 伸縮では 2964/cm、O-H 伸縮ではそれぞれ 3305/cm でピークに達します。

物理的混合物は、C-O 伸縮のピークを 1085/cm で示しました。これは、一級アルコールの存在によるものと考えられます。 C-O 伸縮の 1167/cm はエステル基に相当します。共役アルケンの存在による C=C 伸縮の場合は 1603/cm。 C=O 延伸の場合は 1722/cm、芳香族化合物のC-H曲げでは1921/cm。 C-H 伸縮では 2852/cm、2947。 O-H 伸縮の 3600/cm は、それぞれアルコール基の存在によるものと考えられます。

FT-IR研究により、配合成分の適合性が確認されました。物理的混合物のピークは無傷で、個々の成分と相関しており、相互作用は観察されませんでした。

シトロネラ油、クローブ油、レモングラス油およびそれらの混合物の熱安定性はTGAによって調査され、結果は補足図S2に示されています。シトロネラ油は、300 ℃以下で 98.09% の質量損失を示しました。これは、サンプルの有機成分の分解によって引き起こされた可能性があります。クローブ油の重量は 60 ℃までは一定であり、60 ℃から 171.7 ℃までは分解/質量減少が始まりました。 171.7℃から599.6℃までの第2の重量減少領域では、チョウジ油はそれぞれ約0.87％の残留質量を残した。レモングラス油は60℃から228℃の範囲で分解を示した。シトロネラ油、クローブ油、レモングラス油のブレンドは、それぞれ 30 ～ 260 ℃で最初の重量減少領域を示し、すべての EO 成分が分解されました。第 2 の重量減少領域 (228 ～ 600 °C) では、599.6 °C で約 -16.18% の残留質量が残りました。 EO-MRC の TGA プロファイルは、体重減少挙動にかなりのばらつきがあることを示しました。 50 ～ 260 °C の温度範囲内では、撥水クリームベースから負荷された EO 分子が水で除去される可能性があります。 2 番目の重量損失領域は 270 ～ 600 °C で確認され、これは EO-MRC の配合に使用された賦形剤の分解によるものと考えられます。

最適化は、Design-Expert ソフトウェアで満足度関数の基準を設定することによって行われました。ソフトウェアによって 3 次元応答曲面プロットが生成されました (図 1)。これは、応答に対する因子の相互作用効果を研究するのに非常に役立ちます。応答曲面プロットは、一度の応答に対するさまざまな要因の影響を表します36。ここで、図 1 は、蚊に対する完全防御時間 (CPT) に対する EO の異なる濃度の影響を示しています。最適化された式は、最大保護時間の設定基準に基づいています。したがって、予測レベルの配合係数を備えた 17 種類のクリーム配合物が調製されました。非線形のコンピューター生成の 2 次モデルは次のとおりです。

ここで、「Y」は完全保護時間 (CPT) であり、各因子レベルの組み合わせに関連付けられた応答変数です。シトロネラ油 (A)、レモングラス油 (B)、およびクローブ油 (C) は、従属変数のコード化レベル (低レベルと高レベルの 2 レベル) でした。

ソフトウェアで生成された応答曲面プロットは、最大保護時間 (Y1) に対するエッセンシャルオイル濃度 (X1、X2) の影響を示しています。最適化は、Design-Expert ソフトウェア (バージョン 6.0.8、Stat-Ease Inc.、米国、https://www.statease.com/software/design-expert/) を使用して実行されました。最適な配合は、最大保護時間の設定基準に基づいていました。ここで、CPT完全保護時間、CLVクローブオイル、LMGレモングラスオイル、CNLシトロネラオイル。

変数とそのレベルは、予備実験の結果に基づいて選択されました。表 2 に示します。A、B、および C の量の実験計画マトリックスは、ソフトウェアによって生成された 17 の製剤のそれぞれを調製するために使用され、反応が観察されました。同じソフトウェアを使用して ANOVA を実行し、最も効果的な配合を取得しました (表 3)。 17 回の実行、3 因子、3 レベルの Box-Behnken 計画 (BBD) に従って、9 つの配合ソリューションが生成されました (表 4)。最良の EO ベースの蚊よけクリーム配合物は、以下の組成であることが判明しました: 8.13% シトロネラ油、4% クローブ油、4% レモングラス油、および 100% (w/w) に適量の賦形剤、および最適化された配合50 g EO-MRC の場合の結果を表 5 に示します。

EO-MRC は Ae に対して有望な結果を示しました。ヒトスジシマカ。 EO-MRC の CPT 値を評価し、DBMC と比較しました。忌避性の値は、IBM SPSS Statistics 21 ソフトウェアを使用して評価されました。カプラン・マイヤー生存関数の実行。 EO-MRC と DBMC の CPT は、それぞれ 228 分と 285 分と測定されました。結果を表６および図２に示す。

完全保護時間 (CPT) を決定するための、EO-MRC および DBMC に対する累積生存時間対時間のプロット。 CPT 値は、EO-MRC および DEBA ベースの市販クリーム (DBMC) について評価されました。データは、IBM SPSS Statistics 21 ソフトウェア (バージョン 21.0、1 New Orchard Road、Armonk、New York 10504-1722、United States、https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software) を使用して評価されました。カプラン・マイヤー生存関数を実行して、EO-MRC および DBMC の CPT を決定しました。

14 種類の EO の GC-MS 分析に基づいて、さまざまな化学成分が同定されました。これらは、これらの特定の油の主要な化学成分であることが知られています (表 7)。私たちは以前の研究記事で、これら 14 個の EO の GC-MS 結果を報告しました 37。化学組成、すなわち、カレン、カリオフィレン、シトラール、d-リモネン、ベツラ油、カンフェン、カルベオール、シンナムアルデヒド、カリオフィレン、シトロネラール、シトロネロール、リモネン、オイゲノール、ゲラニオール、イソネラール、リナロール、ロンギフォレン、1-4-テルペネオール、α-テルピネオールは GC-MS によって同定されました。ここでは、これらの化学物質 (リガンド) の蚊の触角タンパク質への結合親和性に焦点を当てるために分子ドッキングを実行しました。これは、この研究分野に関する最初の報告となる可能性があります。

オイゲノールとシトロネロールに対して 4 つのポイント（濃度）検量線が作成されました（補足図 S3）。 EO-MRC 中のオイゲノールとシトロネロールのパーセンテージアッセイは、それぞれ 60.59% と 55.08% であることがわかりました。 EO-MRC の GC-MS クロマトグラムを図 3 に示します。 EO のさまざまな化学成分、つまりカレン、カンフェン、o-シメン、d-リモネン、ユーカリプトール、リナロール、シトロネラール、イソネラール、イソボルネオール、l-アルファ-テルピネオール、シトロネロール、シトラール、ゲラニオール、オイゲノール、カリオフィレン、ミリスチン酸イソプロピルがEO-MRCで同定されました。

EO-MRC の GC-MS クロマトグラム。ここで、1: 3-カレン; 2：カンフェン。 3：o-シメン。 4: d-リモネン。 5：ユーカリプトール。 6：リナロール。 7：シトロネラール。 8: イソネラル。 9：イソボルネオール。 10：l-アルファ-テルピネオール。１１：シトロネロール； 12：シトラール。 13：ゲラニオール。 14：シトラール。 15：オイゲノール。 16：カリオフィレン。１７：ミリスチン酸イソプロピル； 18: 1-ヘキサデカノール; 19: 1-ヘキサデカノール。

EO-MRC およびプラセボ製剤は、美的外観を備えた均一で安定した水中油型エマルションを得るために調製されました。 EO-MRC は、良好な均一性と拡散能力を示し、許容可能な臭気と色を示しました。 EO-MRCおよびプラセボ製剤のpHは、それぞれ7.3±0.08および6.93±0.13であることが判明した。密度 (1.02 ± 0.01 g/mL) および粘度 (28,878.33 ± 594.99) の値は、EO-MRC の十分な安定性を示しました (データは補足表 S1 に示されています)。さらに、製剤の保存期間を確立するには、長期保存の影響に関する研究が必要です。

EO-MRC 濃度の増加に伴い、ヒト肺上皮細胞 (L-132) 死亡率の減少パターンが観察されましたが、異なる EO-MRC 濃度への曝露後は細胞生存率の顕著な減少が見られました。図 4 は、コントロール (未処理) および 62 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、および 1000 μg/mL の EO-MRC 製剤に対する、MTT アッセイによる推定細胞生存率を示しています。 L-132培養物。 500 μg/mL および 1000 μg/mL の濃度では、細胞生存率が大幅に減少 (p < 0.001) することが証明されましたが、250 μg/mL の濃度でも細胞生存率が阻害され (p < 0.05)、EO-MRC 濃度が 62 μg/mL でした。 125 μg/mL では、未処理の L-132 細胞株と比較して、細胞生存率に有意な差は示されませんでした。 ANOVA に続いてダネットの多重比較検定。ここで、NS = p > 0.05; *p ˂ 0.05; ***p ˂ 0.001 それぞれ。

異なる試験濃度での EO-MRC の細胞生存率研究の比較ヒストグラム。 EO-MRC の濃度が増加すると、ヒト肺上皮細胞株 (L-132) の死亡率の減少パターンが観察されました。 EO-MRC 濃度が 500 および 1000 μg/mL の場合、細胞生存率が大幅に低下することが証明されました (p < 0.001)。 L-132 も 250 μg/mL の EO-MRC によって有意に (p < 0.05) 阻害されましたが、62 μg/mL および 125 μg/mL の濃度では、未処理または対照 L と比較して細胞生存率に有意な差は示されませんでした。 -132細胞株。 ANOVA とそれに続くダネットの多重比較検定。ここで、 NS = p > 0.05; *p < 0.05; ***p < 0.001。

この研究では、プラセボ治療ウサギ群とEO-MRC治療ウサギ群の両方において、72時間の治療期間後に紅斑や浮腫などの有害な皮膚反応は観察されませんでした。しかし、陽性対照群のウサギは、72 時間の治療後に重度の紅斑および浮腫を発症しました。プラセボ治療群と EO-MRC 治療群の両方の PII 値は 0 であることが判明し、これは EO-MRC の非刺激性の性質を示しています。陽性対照群は、PII 値約 5.16 を示し、標準ガイドラインに従って重度の刺激を示しました (データは補足表 S2 にあります)。

研究期間中、治療に関連した臨床徴候は観察されませんでした。紅斑や浮腫は存在せず、皮膚の治療領域は擦過傷もありませんでした。運動活動の異常も見られませんでした。毎日の食事と水の摂取量は正常でした。すべてのラットの体重は正常で、活動的で健康そうに見えました。皮膚の組織病理学的観察は、表皮（ED）、真皮（D）、脂腺（SG）および毛包（HF）の正常な構造を証明するものであり、図5aに示す対照皮膚。図5b EO-MRC処理した皮膚。 EO-MRCの反復皮膚治療は、対照群と比較して、動物の体重および飼料消費量に悪影響を引き起こさなかった。すべての動物は研究期間を通じて健康であることが判明した。

ラットにおける EO-MRC の反復皮膚毒性研究における皮膚組織の組織病理学 (a) 対照皮膚。 (b) EO-MRC 処理された皮膚。組織病理学的研究では、EO-MRC に曝露された皮膚組織には顕著な変化は観察されませんでした。 D. レリオ鰓組織の組織病理学 (c) 対照鰓。 (d) EO-MRC 露出鰓。 (e) デルタメトリンが露出した鰓。 EO-MRC 露出鰓は、対照群と同じ組織構造を示します。 DLM に曝露されたグループ (陰性対照) は、組織構造に異常を示します。白い矢印: 基底過形成。 EI: 赤血球浸潤。 EL: 上皮リフティング。

ウサギの急性眼刺激性研究から、我々の結果は EO-MRC を非刺激性として分類しました (図 6)。しかし、防衛利用に特に使用される既知の刺激物であるカプサイシン (陰性対照群) は、刺激反応が 48 時間以内に観察されたため、(UN-GHS システムに従って) カテゴリー 2B に分類されました。

対照（未処理）、EO-MRC、カプサイシン（陰性対照）曝露群の1時間、24時間、および48時間後のウサギの眼に対する急性眼刺激研究。カプサイシンは、ここでは既知の刺激物として使用され、動物反応の可逆性としてカテゴリー 2B に属する、防御利用下のカプシグラネードに特に使用されました。 EO-MRC曝露群は眼組織に対して非刺激性であることが証明された。

最も頻繁に起こる病理学的変化は、上皮の持ち上げ、赤血球の浸潤、および塩基性過形成でした。観察されたすべての形態学的変化において、デルタメトリン (DLM) は鰓の構造に対してより深刻な影響を示しました。 EO-MRC 曝露群では鰓組織に対する最小限の毒性が観察され、赤血球浸潤および基底過形成によって証明されました。結果を図5cに示します。対照のえら。図 5d EO-MRC 露出鰓。図5e：デルタメトリンが露出した鰓。

AChE酵素はシナプス間隙に位置し、神経伝達物質アセチルコリン（ACh）を酢酸とコリンに加水分解し、シナプス伝達を停止させます。 AChE 活性の変化は、コリンエステラーゼ阻害剤として作用する特定の化学物質または殺虫剤への曝露によって生じる可能性があります。図7aに示す値から、トランスフルトリン（TNSF）曝露ラットでは、対照（177±28単位）と比較して、AChEの活性レベルがそれぞれ有意に（p < 0.01）減少した（83±15単位）ことが明らかでした（177±28単位）。 EO-MRC に曝露されたラットでは、AChE の有意な減少 (p > 0.05) は記録されず、その値はそれぞれ 132 ± 13 単位であることが判明しました。 ANOVA とそれに続くダネットの多重比較検定。ここで、 NS = p > 0.05; **p < 0.01。

AChE 活性の変化は、コリンエステラーゼ阻害剤として作用する特定の化学物質または殺虫剤への曝露によって生じる可能性があります。 EO 成分のほとんどは AChE 阻害剤として報告されています。（a）TNSFおよびEO-MRC曝露後のウィスターラットにおけるAChE活性アッセイ。 TNSF曝露群ではAChEの有意な減少(p<0.01)が観察された。 EO-MRC曝露群は、対照群と比較してAChE濃度に有意差を示さなかった(p > 0.05)。 (b) ImageJ によって定量化された、TNSF および EO-MRC に曝露された後の蚊の頭部における TRPV1 および Anti-OBP2A の相対発現レベル。 EO-MRV に曝露された蚊頭部分 (13.02 ± 2.05) では抗 OBP2A の有意な過剰発現 (p < 0.01) が観察されましたが、TNSF 曝露群の場合、発現レベルは抑制されました (p > 0.05)。 EO-MRC に曝露された蚊は、対照蚊と同様の発現レベルを示しました (p > 0.05)。同様の発現パターンが TRPV1 でも記録されています (p > 0.05)。 TRPV1 発現は、対照と比較して、TNSF に曝露された蚊で低かった (p > 0.05)。ただし、EO-MRV に曝露された蚊の場合、TRPV1 のより高い発現が観察されましたが、EO-MRC 曝露群の蚊では対照と比較して有意な変化は記録されませんでした (p > 0.05)。 ANOVA とそれに続くダネットの多重比較検定。ここで、 NS = p > 0.05; **p < 0.01。元のブロット/ゲルを補足図に示します。 S9 – 図。 S11.

EO-MRV、EO-MRC、TNSF、およびコントロールの蚊について得られたタンパク質濃度は、それぞれ 7.14 mg/mL、3.03 mg/mL、9.146 mg/mL、および 3.275 mg/mL でした。これらの濃度に基づいて、50 μg タンパク質を含む各処理サンプルの量を計算し、それぞれの SDS PAGE ゲルにロードしました。したがって、前述の濃度に基づいて、6.68μL、16.4μL、5.46μL、および15.26μLのEO-MRV、EO-MRC、TNSFおよび対照サンプルをそれぞれSDS PAGEにロードした。

ImageJによって定量化されたTRPV1およびAnti-OBP2Aの相対発現レベルを図7bに示します。対照として、ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンを他の抗体のブロッティングの前に実験したところ、蚊の頭部で高度な発現が示されました。抗OBP2Aの発現は22 kDaで示され、EO-MRV曝露蚊頭部分(13.02±2.05)ではより高い発現(p<0.01)を示したが、TNSF曝露群の場合、発現レベルは抑制された(3.37±0.93)。 )、(p > 0.05)。 EO-MRC に曝露された蚊は、対照蚊 (6.62 ± 1.43) と同様の発現レベル (6.6 ± 1.5) を示し、有意差は観察されませんでした (p > 0.05)。対照と比較して、TRPV1 について EO-MRC 曝露群の蚊には有意な変化 (p > 0.05) は記録されませんでした (2.9 ± 0.28)。蚊の頭部の TRPV1 は、予想される分子量 100 kDa のバンドを示しました。バンド強度に関して、WB は TRPV1 発現が低いことを示しましたが、対照サンプル (3.23 ± 0.88) と比較して、TNSF に曝露された蚊 (2.07 ± 0.58) では有意ではありませんでした (p > 0.05)。しかし、EO-MRV に曝露された蚊の場合、TRPV1 のより高い発現 (p > 0.05) が記録されました (4.95 ± 1.44)。 ANOVA とそれに続くダネットの多重比較検定。ここで、 NS = p > 0.05; **p < 0.01。

分子ドッキング研究から、選択した 3 つの標的タンパク質すべての活性部位とより良好に結合する傾向を示す 8 つの化合物、すなわちダバナ油、シンナムアルデヒド、シトロネラール、シトロネロール、エストラゴール、オイゲノール、メチルオイゲノール、および o-シメンを発見しました。データは補足表S3で入手可能)。しかし、両方の蚊種（ヤブカ属とハマダラカ）のOBPの場合、ダケカンバ油は、CDockerエネルギーがそれぞれ-23.5487kcal/molおよび-22.737kcal/molで最良の結果を示しました。一方、ラットの TRPV1 の場合、o-シメンは CDocker エネルギー - 19.981 kcal/mol で最良の結果を示しました。それぞれのターゲットに対する最良の化合物の結合自由エネルギーを補足表 S4 に示します。それぞれの標的に対する 3 つの化合物の相互作用を図 8 に示します。ここで、ダケカンバ油 (サリチル酸メチル) が Phe123 および Ile125 と 2 つの従来の水素結合相互作用を形成することがわかりました。 Leu124との1つの炭素水素結合相互作用。 Phe15、His111、Trp114、Tyr122、およびIle125との6つの疎水性相互作用（P-Piスタックド、アルキルおよびPi-アルキル）。カバノキ油は、Asn84 との従来の水素結合相互作用の 1 つを形成しました。 Tyr132 との 1 つの炭素水素結合相互作用。 Leu72、Tyr73、Val79、Ala121、Ala124、Phe125およびTyr132とハマダラカ種のOBPとの7つの疎水性相互作用（Pi-Pi T字型）、アミド-Piスタック、アルキルおよびPi-アルキル）。 O-Cymene は Leu553 および Ile569 と 2 つの疎水性相互作用を形成しました。ラットのTRPV1のGlu570との1つのPi-Anion相互作用。これらの相互作用するアミノ酸残基はすべて、選択された標的の報告されている活性結合部位の重要な構成要素です。残りの化合物の相互作用は補足資料に記載されています（補足図S5〜図S7）。

カバノキ油（サリチル酸メチル）、シンナムアルデヒドおよびオイゲノールの相互作用。ヤブネズミの臭気物質結合タンパク質 (OBP) (a)、ハマダラカの OBP (b)、およびラットの TRPV1 タンパク質 (c)。カバノキ油は、Phe123 および Ile125 と 2 つの従来の水素結合相互作用を形成しました。 Leu124との1つの炭素水素結合相互作用。 Phe15、His111、Trp114、Tyr122、およびIle125との6つの疎水性相互作用（P-Piスタックド、アルキルおよびPi-アルキル）。 O-Cymene は Leu553 および Ile569 と 2 つの疎水性相互作用を形成しました。ラットのTRPV1のGlu570との1つのPi-Anion相互作用。これらの相互作用するアミノ酸残基はすべて、選択された標的の報告されている活性結合部位の重要な構成要素です。

合成忌避剤には常に問題があり、その副作用や使用者への毒性、生態系や対象外の生物への悪影響により、世間の認識は否定的です38、39、40。 EO にはテルペノイドが豊富に含まれており、その殺虫性と忌避性により蚊に対して効果的です。それらは経済的で、安全で、簡単に入手でき、毒性が低く、複雑な化学反応により昆虫に対する抵抗力の可能性を減らします。我々の以前の研究では、「Y」字管嗅覚計を使用したバエバエに対する14のEOの誘引および忌避アッセイを報告しました。クローブ、シトロネラ、レモングラスオイルのブレンドは、最大の飛行方向応答を示しました。この研究でも、K&D 研究ではシトロネラ、クローブ、レモングラス油のブレンドが蚊に対して最良の結果を示しました。 EO の有効性は、各オイルに含まれるさまざまな植物成分によって異なります。

特性評価では、FT-IR 研究により、EO とその他の補助配合成分が相互に適合し、物理的混合物のピークが損なわれておらず、個々の化学物質と相関していることが確認されました。 TGAサーモグラムは30℃から600℃までの温度上昇の関数としてEOの重量減少率を示した。クローブ油の減量開始温度は 80 ～ 90 ℃であると以前報告されていました 41。私たちの研究では、EO-MRC は 50 ～ 260 °C で最初の重量減少領域を示しました。これは、撥水クリームベースから水分を含む負荷された EO 分子が除去されたためである可能性があります。 2 番目の重量損失領域は 270 ～ 600 °C で確認され、これは EO-MRC の配合に使用された賦形剤の分解によるものと考えられます。同様の研究がSattaryらによって行われた。は、小麦のテイクオール病に対して、レモングラス油とクローブ油をカプセル化した抗真菌性メソポーラスシリカナノ粒子を調製しました42。 GC-MS は、Eos に存在する化学組成の同定と、EO-MRC に存在するオイゲノールとシトロネロールの分析の評価に利用されました。揮発性化合物および半揮発性化合物の同定と定量では、GC-MS により高いスループットと高感度の分析結果が得られました 43。

カプラン・マイヤー生存関数は、Gray らによって以前に利用されていました。ピレスロイド耐性Aeの毎日の死亡率を決定する。殺虫剤暴露後の各日のネッタイシマカ44。治療後に生存している被験者、生存している被験者、または保護されている被験者の割合を測定するには、カプラン・マイヤー推定値が最適な選択肢の 1 つです 45。この研究では、WHO46 が推奨する標準検査ガイドラインに従って CPT を決定するために蚊のバイオアッセイが実施されました。 EO の有効性は Azeem らによって以前に報告されています 47。彼らは、ケージバイオアッセイで脇の下で45分以上の保護時間を明らかにしました47。私たちの研究結果では、EO の最適なブレンドを製剤に加工した後、開発された製品はそれぞれ最大 228 分まで完全な保護を与えたことが確認されています。

EO に存在する親油性分子は、通過する細胞膜が 1 つしかないため、ユーザーの肺細胞に直接侵入する可能性があります。そのため、EO-MRC から EO フレグランスを吸い込むことの影響はかなり大きい可能性があります。 EO の過剰使用により肺に毒性が生じる可能性がありますが、実際の濃度は解明されておらず、入手可能な研究はほとんどありません 48。香料・抽出物製造業者協会 (FEMA) は、ほとんどの EO に一般に安全と認められる (GRAS) ステータスを付与しており、それらは食品、化粧品、医薬品への使用が米国食品医薬品局 (US FDA) によって承認されています。 FEMA の専門家委員会による評価を経て、1996 年にこれが見直されました。基本的に、100 ppm 未満のほとんどの香料成分は暴露に使用でき、その安全性に関する予測は評価可能です49。したがって、L-132 に関する我々の研究結果から、EO-MRC は肺細胞に悪影響を及ぼさずに効果的な蚊よけに適していると考えられるかもしれません。

急性皮膚刺激性試験の決定は、製剤が皮膚に暴露される場合に役立ちます。これは、経皮経路による短期間の曝露によって生じる可能性のある健康被害に関する情報を提供します50。ウサギを対象とした EO-MRC の急性皮膚刺激試験および Wistar ラットを対象とした反復投与経皮毒性試験により、EO-MRC が安全であり、皮膚に有害な影響を与えないことが確認されています。急性眼刺激研究において、EO-MRC はあらゆる眼組織に対して非刺激性であることが証明されました。試験物質は、結膜発赤≧ 2 の陽性反応を示す場合、国連化学物質の分類および表示に関する国際調和システム (UN GHS) の眼刺激性カテゴリー 2A に分類されます。結膜浮腫 ≥ 2 角膜混濁 ≥ 1; 虹彩炎≧1; 試験物質の点滴後 24 時間、48 時間、および 72 時間という異なる時間間隔で採点した後の平均スコアとして推定され、21 日の観察時間内に完全に逆転します。上記の影響が 7 日間の観察期間内に完全に可逆的である場合、被験物質はカテゴリー 2B51 に分類されます。

合成ピレスロイドと有機リン酸塩は、魚やその他の水生動物に対する脅威になりつつあります52。 Hedayati らは、有機リン酸塩およびピレスロイド系殺虫剤に曝露された虹色のサメ (Pangasius Hyptalmus) に関する血液学的および鰓の組織病理学的データを報告した 53。私たちの研究では、D. rerio に対する非標的毒性により、EO-MRC の非毒性が確認されました。ここでも、DLM をネガティブコントロールとして使用しました。 EO-MRC の魚の鰓組織病理学は、未処理 (対照) 鰓と同じ組織構造であることが判明しました。 D.レリオの鰓に関する我々の所見は、魚の鰓の組織病理学に関して以前に報告されたものと同様の結果をもたらした。

TNSF に曝露されたラットの脳では AChE の減少が確認されており、これは脂質過酸化の増加 54 と、代謝および神経活動の混乱の可能性 55 に関連している可能性があります。しかし、EO-MRCに曝露されたラットは対照ラットとの間に有意差を示さなかった。 AChE の活性の増加は ACh の量の減少を引き起こし、それにより血流の減少と血管拡張が引き起こされます 56。総頸動脈の結紮による脳灌流低下では、海馬領域の ACh の減少が記憶および学習障害の原因となります 57。さまざまな研究研究において、アルツハイマー病患者における血管周囲のコリン作動性終末の喪失が報告されています58,59。さらに、AChE阻害薬は、低圧低酸素症で治療されている被験者のコリン作動性機能（↓AChE活性、↑AChレベル、およびACh形成に関与する酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼの上方制御）、そして最終的には記憶機能に影響を与えることが知られています60。

匂い結合タンパク質（OBP）は、昆虫の半化学的受容における最初の中継器であり、化学信号を伝達する空気媒体と、昆虫の末梢組織の嗅覚構造（主に触角と上顎歯髄）に位置する匂い受容体との間の連絡役である。感覚系61． EO-MRCに曝露されたラット頭部ではOBP-2Aの有意な発現は見られなかったが、同じEOを含むEO-MRVに曝露された蚊はOBP-2Aの過剰発現を示した。これは、対象グループに対する EO の曝露パターンが原因である可能性があります。これは、EO が蚊の OBP を過剰発現する能力を持っていることを裏付けています。合成 TNSF に曝露された蚊の頭部の場合、OBP-2A は阻害されました。 TRPV1の場合、EO-MRV曝露した蚊の頭部はこのタンパク質の過剰発現を示し、EO-MRC曝露群は変化を示さず、TNSF曝露群はTRPV1の阻害をそれぞれ示した。これは、TRPV1 が炎症組織でより多く発現していることを示している可能性があり、それによって蚊の触角炎症カスケードにおける TRPV1 の重要性が関連付けられています。抗OBP2A抗体の場合にも同様の結果が観察された。これは、蚊の頭部におけるTRPV1および抗OBP2A抗体の発現を実証した最初の報告である。昆虫は少なくとも 3 つの嗅覚受容体ファミリー、すなわち臭気受容体 (OR)、イオンチャネル受容体 (IR)、および味覚受容体 (GR) を使用します 12,62。 DEET は、嗅覚受容体ニューロン (ORN) を誘引物質に対して覆い隠し、乳酸興奮ニューロンの反応を低下させ、乳酸抑制ニューロンの抑制を高めることによって、ヒトの汗の成分である乳酸に対する感受性を低下させます 12。

EO-MRC は蚊に対して非常に有望な結果を示しました。 WB 分析は、有効成分として EO を含む開発された製剤で処理した場合の標的タンパク質の有意な発現を裏付けました。したがって、インシリコ研究では、忌避活性を担う EO に存在する正確な分子を見つけようとしました。インシリコドッキング研究から、蚊およびラット種の標的タンパク質と結合して安定なタンパク質-リガンド複合体を形成するためのより優れた親和性を示す8つの化合物が同定されました。インシリコ研究により、同定された EO の 8 つの化合物が、開発製品の全体的な忌避特性に重要な役割を果たしていることが明らかになりました。

バジル (Ocimum basilicum L.)、ベルガモット (Citrus bergamia Risso & Poit)、カンファー [Cinnamomum Camphora (L.) J. Presl.]、シナモン (Cinnamomum zeylanicum Blume)、シトロネラ [Cymbopogon nardus (L.) Rendle] の EO 、クローブ（Eugenia caryophyllus Wight）、ユーカリ（Eucalyptus globulus Labill.）、ジャスミン（Jasminum officinale L.）、ラベンダー（Lavandula angustifolia Mill.）、レモングラス［Cymbopogan citratus (DC.) Stapf］、ハッカ（Mentha Piperita L. ）、ローズマリー（Rosmarinus officinalis L.）、パチョリ（Pogostemon patchouli Benth）、および野生ターメリック（Curcuma armatica Salisb.）は、Talent Technologies（Talent Technologies、インド、カンプール）から調達しました。アセチルコリンエステラーゼ (AChE) 活性アッセイキット、抗 OBP2A 抗体、ELISA キット、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル (DPPH)、放射性免疫沈降 (RIPA) 緩衝液およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) は、Sigma Aldrich (Sigma Aldrich Chemical) から購入しました。 Co.、セントルイス、米国）。 TRPV1 抗体は、Santa Cruz (Santa Cruz、California、USA) から購入しました。 1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン (CDNB) は、Cayman (米国ミシガン州の Cayman Chemical Company) から購入しました。ヒト正常肺細胞株 (L-132) は、インドのプネにある国立細胞科学センター (NCCS) から入手しました。高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレードのアセトンは、Merck (Merck Pvt. Ltd.、ムンバイ、インド) から購入しました。使用された他の化学物質はすべて、入手可能な最高の分析グレードのものでした。

生後5～7日の成人雌Ae。ヒトスジシマカ属の蚊は、インド、アッサム州テズプールにある国防研究所製薬技術部門の実験昆虫室で飼育されました。蚊は、標準サイズの木製ケージ (75 cm × 60 cm × 60 cm) 内で、温度 27 ± 2 °C、相対湿度 75 ± 5% RH、および 14L:10D 時間の明暗交互サイクルを維持して飼育されました。前述したように片側の袖開口部63。栄養補給のために10%スクロース溶液を自由に与えた。テスト前に、蚊を 24 時間絶食させました。

14 の EO の中で最良のオイルを評価するために、用量反応研究が実施されました。この研究は、インド、アッサム州テズプールのテズプール医科大学＆病院（TMCH）の施設内人間倫理委員会（IHEC）によって承認され（承認番号：032/2021TMCH、2018年8月28日）、すべての実験が実施されました。関連するガイドラインと規制に従ってください。蚊に刺されたことにアレルギーがなく、すべてのボランティアが書面によるインフォームドコンセントを提出した 5 人のボランティアが選ばれます。 Klun と Debboun64 が説明したように、ボランティアの太ももには K&D モジュールのドア開口部の穴に従ってマークが付けられました。それはプレキシガラスで作られており、長方形のケージの底部（26 cm × 5 cm × 5 cm）には6つの穴があり、それぞれにはスライドドアによって開閉される長方形の3×4 cmの穴があります（補足図S8：提供）写真はK&Dモジュール）。人間のボランティアの前腕の屈筋領域の輪郭を 4 つの長方形 (3 cm × 4 cm) のテスト領域で描きました。大豆油中の各濃度の EO (40、4、および 0.4 μg/cm2) 25 μL と、対照としての大豆油 (希釈剤) 25 μL をマークした領域に適用しました。 5分間空気乾燥させた後、床に一致する切り欠きを備えたK&Dモジュールを処理領域の上に置き、各穴に生後5〜7日の未経産メス蚊5匹を入れました。独房のドアを開け、各独房に刺さった蚊の数を 2 分間の曝露内で記録し、その後ドアを閉めました。各観察の完了後、スリーブ付きスクリーンケージ内の K&D モジュールのセルを開けて蚊を放しました。各テストでは、新鮮な蚊のセットが使用されます。各テストについて 5 回の反復を実行しました。 EO の有効性は、式または式を使用して、蚊に対する忌避率のパーセンテージによって決定されました。 (2) WHO46 によって記述されています。

ここで、C は対照領域に着陸する、または刺咬する蚊の数です。 T は、治療領域に着陸または刺咬する蚊の数です。

配合成分ごとに化学的適合性の検討が必要です。すべての配合成分は特定の値の振動周波数を持ち、化学構造中にさまざまな官能基を持っています。適合性研究のために、各 EO、クリーム製剤に使用される賦形剤、およびそれらの物理的混合物を FT-IR 装置 (Bruker、ALPHA、Billerica、MA、USA) のサンプルプレート上に 1 つずつ配置しました。カバープローブをサンプル上に置き、室温で 2.5 ～ 25 μm の波長にわたって IR スペクトルを取得しました。個々の成分が持つ官能基は物理的混合物中で同一である必要があり、これによりそれらの適合性が確認されます37。

シトロネラ油、クローブ油、レモングラス油、それらの混合物および EO-MRC の熱挙動は、熱分析装置 (TG 209 F1 Libra®、NETZSCH-Gerätebau GmbH、95100 Selb、ドイツ) を使用して評価されました。毎回約１０ｍｇのサンプル重量をるつぼに入れた。シールドガスとして窒素を使用しました。加熱プログラムは、10 °C/分の速度で 30 ～ 600 °C に固定されました。

最適化のために、17 回の実行、3 因子、3 レベルの Box-Behnken 計画 (BBD) が利用されました。二次多項式モデルは、Design-Expert ソフトウェア (バージョン 6.0.8、Stat-Ease Inc.、米国) を使用して、二次応答曲面法 (RSM) によって構築されました。独立変数または応答変数としての完全保護時間 (CPT) に対する従属変数として EO 濃度を使用して、合計 17 の製剤が得られました。最も効果的な配合を得るために、同じソフトウェアを使用して分散分析 (ANOVA) を実行しました。

転相温度法を EO ベースの蚊よけクリーム (EO-MRC) の調製に適用しました。さまざまな定性的および定量的アッセイを実行するのに十分な量を得るために、約 50 g のクリームサンプルを調製しました。油相（相 B）は、熱磁性プレートスターラー（マグネティックスターラー IKA RCT ベーシック）で 200 rpm で穏やかに加熱しながら、相 A（蚊よけ活性成分）を除く油溶性賦形剤を溶解し、65 °C に加熱することによって調製しました。。水相は、穏やかに加熱および撹拌しながら、様々な水溶性成分（相Ｃ）を混合することによって調製した。水相の温度を65℃まで上昇させた。２００ｒｐｍの撹拌速度および５５±２℃で、相Ａを油相に静かに加えた。次いで、相Ｃをゆっくりと添加することによって混合物を乳化し、８００ｒｐｍの撹拌速度および６０±２℃で１時間維持した。次いで、配合されたＥＯ－ＭＲＣを自然冷却のために保管した。

開発されたクリーム (EO-MRC) 製剤の CPT は、アームインケージバイオアッセイによって実行されました。 1 mL の EO-MRC を手首と肘の間の前腕の皮膚の約 600 cm2 の領域に塗布し、1 mL の 12% N, N-ジエチルベンズアミド (DEBA) ベースの市販クリーム (DBMC) をもう一方の腕で比較しました。。 2 つの蚊かご (サイズ: 40 × 40 × 40 cm) それぞれに 200 ～ 250 匹の非吸血雌蚊帳が入っています。ヒトスジシマカを使用した。 1 つのケージは EO-MRC のテスト用に指定され、もう 1 つのケージは陽性対照 (DBMC) 用に指定されます。テスト中、ボランティアは腕の動きを避けながら、蚊に刺されないように手術用手袋で手を保護しました。 EO-MRC および DBMC で処理したアームを 30 分間隔で 3 分間曝露し、着陸および/または探査活動を測定しました。 3 分間のテスト間隔内で蚊が 1 回着陸または探査されると、テストが終了します。 CPTは、処理領域に忌避剤を塗布した後、最初の蚊の着地または探査に必要な時間（分）として計算されました。 CPT 中央値と信頼区間は、カプランマイヤー生存関数から推定されました 46。

有効性は DEBA ベースの市販クリーム (DBMC) と相関していました。特定の市販製品 DBMC を含めることは比較のためであり、推奨を構成するものではありません。

14 個の EO と選択したブレンドのさまざまな化学成分は、Agilent Technologies (5301 Stevens Creek Blvd. Santa Clara, CA 95051, United States) の GC-MS システムによって同定されました。 500 μg/mL の濃度の試験サンプルを GC グレードのアセトンで調製しました。 1 μL のサンプル量を 250 °C に保ったインジェクターに導入しました。オーブン温度は 40 ～ 300 °C で 20 °C/min にプログラムされました。ヘリウムを流量 1 mL/min でキャリアガスとして使用しました。インジェクターと検出器の温度は、それぞれ 250 °C、230 °C (クワッド)、および 150 °C (コア) に設定されました37。標準的な C7 ～ C30 飽和アルカンは、米国セントルイスの Sigma Aldrich Chemicals Co. から購入しました。検出された成分の同定のために、同定された成分の保持指数（RI）が決定されました。

オイゲノールとシトロネロールの校正サンプルは、適切な量を GC グレードのアセトンに溶解して、62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、および 500 μg/mL の濃度になるように調製しました。 EO-MRC、クローブ油、およびシトロネラ油の試験サンプルは、最終配合物中の EO 成分を定量するために、必要な量をアセトンに溶解することによって調製されました。「定性研究」セクションで説明したように、1 μL のサンプル量をインジェクターに導入しました。

EO-MRC およびプラセボ製剤の物理的パラメーターは、美的コンプライアンスと消費者受容性を確立するために決定されました。粘度を測定するために、プログラム可能な粘度計 (モデル: DV2T、Ametek Brookfield、ミドルボロ、マサチューセッツ州、米国) を使用しました。ソフトウェア Rheo3000、バージョン 1.2.2019.1 [R] と組み合わせます。サンプル量を 30 g に固定し、T-Bar スピンドル (B-92) (Helipath スピンドルセット、Brookfield Engineering Labs. Inc) を使用して、室温で 10 rpm で 40 秒間粘度を測定しました。密度は比重計を使用して測定されました。ＥＯ－ＭＲＣのｐＨは、デジタルｐＨメーター（ＬａｂｍａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ、タミル・ナドゥ、インド）を使用してチェックした。

EO-MRC の拡散能力は、Sabale65 によって以前に報告された方法に従って決定されました。簡単に説明すると、1 g の EO-MRC を、スライドガラス (7.5 cm × 2.5 cm) 上のあらかじめマークされた 1 cm2 の円形領域に配置しました。 EO-MRC は、一次スライドの端から中心まで配置された別のガラススライドを使用して圧縮されました。市販の重り 200 g をセットアップに置き、ゲルを 1 分間広げました。方眼紙を用いて散布径を計算し、式（１）に示す式を用いて散布能力を評価した。 (3):

ここで、m はセットアップにかかる商用重量です。 l はクリームスプレッドの長さです。そしてtは時間です。

テトラゾリウム塩の還元は、細胞増殖を検査する信頼できる方法として現在広く受け入れられています。黄色のテトラゾリウム MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド) は、部分的にデヒドロゲナーゼ酵素の作用により、代謝活性のある細胞によって還元され、NADH や NADPH などの還元等価物が生成されます。分光測光手段の助けを借りて、結果として生じる細胞内紫色のホルマザンを定量することができます。このアッセイでは、細胞増殖率を測定し、逆に、代謝イベントがアポトーシスまたは壊死を引き起こす場合、細胞生存率の低下を測定します66。

T-25 フラスコで培養した細胞をトリプシン処理し、5 mL 遠心分離管に吸引しました。３０００ｒｐｍでの遠心分離により細胞ペレットを得た。 DMEM HG培地を使用して、200μLの懸濁液に約10,000個の細胞が含まれるように細胞数を調整した。 96 ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに 200 μL の細胞懸濁液を加え、プレートを 37 ℃、5% CO2 雰囲気で 24 時間インキュベートしました。 24 時間後、使用済み培地を吸引しました。 200 μL の異なる試験濃度、つまり 62μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLのEO-MRCをそれぞれのウェルに添加した。次に、プレートを 37 °C、5% CO2 雰囲気で 24 時間インキュベートしました。プレートをインキュベーターから取り出し、薬物を含む培地を吸引した。次に、10% MTT 試薬を含む培地 200 μL を各ウェルに加えて最終濃度 0.5 mg/mL とし、プレートを 37 ℃、5% CO2 雰囲気で 3 時間インキュベートしました。ウェル内に形成された結晶を乱すことなく、培地を完全に除去しました。１００μＬの可溶化溶液（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加し、次いでプレートをロッキングシェーカー（ＲＯＣＫＹＭＡＸ（商標）、ターソンズ、コルカタ、インド）内で穏やかに振盪して、形成されたホルマザンを可溶化した。マイクロプレートリーダーを使用して、波長570nmおよび630nmにおける吸光度を測定した。増殖阻害の割合が計算され、細胞株の用量反応曲線から細胞増殖を 50% 阻害するのに必要な EO-MRC の濃度 (IC50) が生成されました。

動物を使用するすべての実験プロトコールは、「実験動物管理の原則」(NIH 出版物 85-23、1985 年改訂) に従って実行され、アッサム州テズプールにある国防研究所 (DRL) の動物倫理委員会 (IAEC) によって承認されました。インド (承認番号 CPCSEA/DRL/議定書番号 3、2018 年 6 月 20 日)。動物を含むすべての研究は、動物を含む実験を報告するための ARRIVE ガイドラインに従って報告されます67。研究期間中、動物の苦痛を最小限に抑え、使用する動物の数を減らすためにあらゆる努力が払われました。

生後 5 ～ 8 週齢の雄の健康な成体 Wistar ラット (Rattus Norvegicus) および若くて健康なニュージーランドアルビノウサギ (Oryctolagus cuniculus) を約 210 ～ 250 g を施設動物収容施設から入手し、飼育前に 7 日間順応させました。研究。 22～25℃、相対湿度40～70％、12時間の明暗サイクルで清潔で衛生的な状態で、標準的な食品と精製水を自由に与えました。

急性皮膚刺激試験は、OECD テストガイドライン 40468 に従って、健康なニュージーランドのアルビノウサギで実施されました。試験の約 24 時間前に、体幹の背部領域から毛皮が除去されました。 0.5 g の EO-MRC を皮膚に直接塗布し、4 時間の曝露期間後、表皮の完全性を乱すことなく残留 EO-MRC を水を使用して除去し、60 分後に紅斑と浮腫の兆候を調べました。 EO-MRC除去後24時間、48時間、72時間。皮膚反応は、表 8 の等級に従って等級分けされ、記録されます。Banerjee et al.69 によって記載された方法による。一次刺激指数 (PII) を計算しました。さらに、我々は、PII スコアを非刺激性 (PII < 0.5 の場合)、軽度の刺激性 (PII < 2 の場合)、中程度の刺激性 (PII ≤ 2-5 の場合)、および重度の刺激性 (PII の場合) として分類する Draize 法に従いました。 > 5)70 であり、時点ごとの平均刺激スコアが計算されました。次に、1 日目、2 日目、3 日目の平均スコアを合計し、方程式に従って PII を取得しました。

ここで、Xa は紅斑形成の平均スコアです。 Xb は浮腫形成の平均スコアです。 \(t\_1\) は 1 日目です。 \(t\_2\) は 2 日目です。 \(t\_3\) は 3 日目です。

OECD ガイドライン 41071 に従って、EO-MRC の反復投与経皮毒性試験が 21 日間実施されました。健康なウィスターラットを２つの異なるグループ（対照およびＥＯ－ＭＲＣ処理）に分けて飼育し、研究前の少なくとも５日間の最初の順応後に各グループに０６匹の動物を含めた。簡単に説明すると、滅菌外科医用脱毛刃 (49 ～ 20 mm) を使用して背部の毛皮を除去し、4.0 × 4.0 の背部領域をプラセボおよび試験物質で少なくとも 6 時間/日、週 5 日ベースで 21 日間処理しました。。体重と飼料摂取量に関する観察は毎日監視されました72。

この実験では、OECD TG 405、急性眼刺激性試験手順が若くて健康なウサギに対して実施されました50。右眼球の下まぶたを軽く引っ張ることにより、50 mg の EO-MRC を結膜嚢に 5 秒間配置しました。ここで、左目を対照として使用した。眼刺激物質であるカプサイシンを陰性対照として使用した。カプサイシンの投与後、次の 24 時間は動物の目を洗わなかった。 1 時間、24 時間、および 48 時間の特定の間隔での眼病変の観察は、細隙灯顕微鏡 (Haagstreit タイプ AIA-11、Appaswamy) を使用して評価されました 73。

ダニオ・レリオ (D. rerio) の急性毒性試験は、経済協力開発機構のガイドラインに従って実施されました (試験番号 203、急性遊泳阻害試験)74。 7 匹の新生児 D. レリオが各試験容器に曝露され、3 回の反復試験が行われ、治療グループあたり合計 21 匹の D. レリオが検査されました。 D. rerio 個体を 250 mL の純水の入った容器に入れ、EO-MRC をアセトンで希釈し、濃度 200、100、および 50 mg/L に相当する用量で水に混合しました。実験は 3 つのグループに分けられました。最初の 2 つのグループは、24 時間 75 時間 EO-MRC および陰性対照デルタメトリン (DLM) の作用に曝露された D. rerio 個体によって形成されました。 3 番目のグループの D. rerio 個体を対照として使用しました。

急性毒性試験の物理的および化学的条件は次のとおりでした。pH は 7.2 ～ 7.6 の範囲でした。 25 ± 1 °C の一定温度; 電気伝導率は約160μS/cm。溶存酸素が 3 mg/L 以上。 3 回の反復実験で死んだ D. レリオの数をカウントし、24 時間の曝露の間の LC50 を決定するために使用しました。

この研究では、トランスフルトリン-1.6% (TNSF) と EO-MRC を異なるラット群 (n = 6) に 21 日間曝露しました。対照動物は曝露を受けなかった。最後の曝露から 24 時間が経過した後、すべての動物を頚椎脱臼により人道的に屠殺しました。脳組織サンプルを収集し、0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.5 を使用して均質化し、その後 14,000 rpm で 5 分間遠心分離しました。アセチルコリンエステラーゼ活性アッセイキット（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 USA; Catalog Number: MAK119）の技術報告書に記載されている手順に従い、清澄な上清をアッセイに使用した。

女性のAeの頭部。以前に EO-MRV (精油ベースの蚊よけ気化器)、EO-MRC、TNSF および対照 (未処理) に曝露したヒトスジシマカ (各グループ n = 100) を単離し、新たに RIPA 緩衝液中でホモジナイズし、12,000 rpm で遠心分離しました。 15分間収集した上清は、さらに使用するために -80 °C で保存しました。 Biorad DC タンパク質アッセイプロトコール (Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ) に記載されている指示に従って、組織サンプル中のタンパク質濃度を測定しました。タンパク質標準曲線を構築するために、実用試薬およびタンパク質標準希釈液を調製しました。 5μLの標準サンプルと組織サンプルを適切なウェルに入れ、続いて25μLと200μLの作業試薬AとBをそれぞれ入れました。マイクロプレートリーダー（Spinco Biotech Pvt. Ltd.、インド）を使用して、15分後に750 nmで吸光度を読み取った。このアッセイの結果から、ブロッティングプロセスでさらにロードするために、50 μg の標準タンパク質に相当する各試験サンプル中のタンパク質の量が計算されました。

必要量の試験サンプルを等量のレムリ緩衝液と混合し、ブロッティングに使用しました。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ゲルは、メーカーの指示に従って 10% アクリルアミド分離ゲル (TGX Stain-FreeTM FastCastTM アクリルアミドキット、Bio-Rad、カリフォルニア州、米国) から調製しました。標準タンパク質マーカー (Precision Plus、Kaleidscope、Biorad) および事前に調製した組織サンプルを、キャストされた SDS-PAGE ゲルの異なるウェルに導入しました。電気泳動は、Mini-PROTEAN® Tetra System および PowerPacTM HC 電気泳動電源システム (Bio-Rad, CA, US) で実行されました。電気泳動後、タンパク質が包埋されたゲルを、Trans Blot Turbo マシンのニトロセルロース膜に 15 mV (15 分間) で転写しました。次に、タンパク質バンドに埋め込まれた膜を新しいペトリプレートに移し、ロッキングシェーカー (Rockymax、Tarsons、コルカタ、インド) 上で、0.1% Tween 20 および 5 を含むトリス緩衝生理食塩水 (TBS) からなるブロッキング溶液中で 1 時間インキュベートしました。 % ウシ血清アルブミン (BSA)。 1時間後、ブロッキング溶液を廃棄し、膜をTBST溶液で3回(3分/洗浄)洗浄した。 TBST 溶液を完全にピペットで取り出し、メンブレンを乾燥させずに、特異的に希釈した一次抗体をメンブレンに加えました。膜を抗OBP2A、TRPV1、およびβ-アクチン一次抗体（トリス緩衝生理食塩水、pH 7.4中の5％BSAで希釈）で別々にプローブし、4℃で一晩インキュベートしました。翌日、メンブレンを TBST で 3 回 (5 分/洗浄) 洗浄し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体 (トリス緩衝生理食塩水、pH 7.4 中の 5% BSA で希釈) と 1 時間インキュベートしました (詳細補足表S5に記載）4℃のロッキングシェーカー上でインキュベート後、新たに調製したECL基質を膜に添加し、G:Box Chemi-XRQゲルドキュメントシステム（Syngene、英国）で直ちに視覚化して解釈しました。バンドの数は、SynGene GeneTools (SynGene Laboratories、ケンブリッジ、英国) で計算されました。結果は 3 つの独立した実験の代表です。すべての WB バンド定量化ステップはカスタム ImageJ (国立衛生研究所、http://rsb.info) を使用して実行されました。 nih.gov/ij/) スクリプト。

分子ドッキング研究は、忌避活性に関連する標的と結合する傾向がある EO の成分を見つけるために実行されました。製剤に使用された EO の成分は GC-MS 分析から特定されました。次に、化合物の SMILE ID を PubChem データベース (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) から取得し、Discovery Studio 2020 分子モデリングソフトウェア (DS 2020) (Dassault BIOVIA、サンディエゴ、米国) にロードしました。）76．化合物の 3D 構造が生成され、スマートミニマイザー法 77 を使用して DS 2020 の標準プロトコルに従って化合物のエネルギー最小化が実行されました。標的タンパク質であるヤブカ属（PDB: 3K1E）およびハマダラカ種（PDB: 3QME）の臭気物質結合タンパク質（OBP）、およびラットの TRPV1（PDB: 5IS0）は、タンパク質データバンク（www.rcsb.org）からダウンロードされました78。。標的タンパク質を洗浄、調製し、エネルギー RMSD 勾配 0.01 kcal/mol で 2000 ステップの「スマートミニマイザー」メソッドを使用してエネルギーを最小化しました 77。その後、選択された標的の活性部位についてタンパク質データバンクに与えられた情報を使用して、ドッキング研究のための結合部位を選択した。ヤブカ属の種の OBP の活性点は X: 13.63、Y: 40.63、Z: 24.92、半径 9.8 Å でした。ハマダラカ種の OBP は、X: 20.17、Y: 31.50、Z: 32.09、半径 7.7 Å でした。ラットのTRPV1の場合、X：107.77、Y：92.80、Z：103.16、半径9.3Åでした（補足図S4）。次に、活性部位における化合物の結合に関する比較的正確な情報を提供する DS 2020 のシミュレーションベースのドッキングプロトコル CDocker を使用してドッキング研究が実行されました 79。生成された最適なドッキングポーズも分析され、標的タンパク質と化合物の間で起こるさまざまな非結合相互作用が観察されました。

MM-PBSA ベースの結合自由エネルギーは、実際の生理学的条件におけるタンパク質 - リガンド複合体の熱力学的安定性に関する正確な情報を提供します 80,81。したがって、ドッキングから選択された化合物の最良の姿勢をさらに分析し、MM-PBSA 法を使用して結合自由エネルギー (ΔG) を計算しました。

本研究では、国際基準に従って、蚊に対する非毒性 EO-MRC 製剤の忌避活性を調査します。ここでテストされた EO-MRC は、Ae に対する有効性試験に合格しました。 OECD テストガイドラインに従って、ヒトスジシマカおよびさまざまな実験動物に対する前臨床毒性。開発された製品は、Ae に対して最長 228 分間効果的に保護します。前臨床環境で健康被害を引き起こすことなくヒトスジシマカを駆除できます。したがって、全体的な研究は、戦略的に蚊刺されを最小限に抑え、蚊が媒介する病気の発生を減らすための、EO ベースの持続性の高い無毒の局所クリーム製剤の開発を実証しています。しかし、この研究は決定的なものではなく、トンネルバイオアッセイ、Y字管嗅覚計などのさまざまなバイオアッセイ手順を使用して、さまざまな系統の蚊を使用した忌避試験に関するさらなる研究を実施する必要があります。より決定的な結果を得るには、EO-MRC の非標的毒性試験、安定性試験、または自己寿命評価が不可欠です。将来的には、最大限の保護時間を達成するために、露出した皮膚における抗蚊製剤の放出を制御するための複数のエマルジョンおよび/またはリポソームクリーム製剤が設計される可能性があります。これにより、屋外条件での投与頻度が減少します。蚊の頭部で利用可能な、より匂いに応答するタンパク質の発現に関する研究は、忌避化学物質のより詳細なメカニズムを理解する上で科学界に貢献する可能性がある。本報告書は、研究生、製剤科学者、製薬会社にとって、旅行者やジャングルでの作戦に従事する軍隊、あるいは蚊の常在地域にいる一般の人々に蚊から身を守るために適用できる、効果的で安全かつ持続性の高いハーブ蚊よけ剤を開発するのに役立ちます。

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ヘマンガ・ハザリカは、国防省、国防研究開発機構（DRDO）、政府に感謝しています。研究フェローシップ (DRL/1206/TC/JRF/04) の提供に対してインドの。著者らは、博士課程の研究活動に必要なすべての支援を提供してくださったインド、アッサム州テズプールの防衛研究所 (DRL) とインド、アッサム州ディブルガルのディブルガル大学管理局 (DU) に特別な感謝の意を表します。著者はまた、この原稿を改訂し、改善するための提案をしてくださった、英国ロンドンのファイザー社シニアディレクターであるリシ・ハザリカ医師に感謝します。インド、アッサム州テズプール大学食品工学技術学部助教授の Sourav Chakraborty 博士に、予定どおりに TGA レポートを提供していただき、心より感謝いたします。 GC-MS データの提供については、インド、アッサム州テズプール、DRL のシニアテクニカルアシスタント、Sumit Kishor 氏。 AEI 研究を支援してくださった、Tezpur の JRF、DRL、Polopalli Subramanyam Raju 氏。匿名の査読者全員も、この原稿の改善に大いに役立つ具体的なコメントを寄せていただき、感謝しています。

製薬技術部門、防衛研究所、テズプール、アッサム州、784001、インド

ヘマンガ・ハザリカ、ハルシタ・クリシュナトレーヤ、ダンスラン・ゴヤリー、プロノベシュ・チャットパディヤイ

Girijananda Chowdhury Institute of Pharmaceutical Science、Dekargaon、Tezpur、Assam、784501、インド

ヘマンガ・ハザリカ＆ハルシタ・クリシュナトレヤ

ユーロフィンアグロサイエンスサービス株式会社 Ltd.、ティルプール、タミルナードゥ州、641603、インド

ヴァルン・チャギ

コロマンデル国際空港 Ltd.、シャミアペット、テランガーナ、500101、インド

ジョヒルル・イスラム

ディブルガル大学薬学部、ディブルガル、アッサム州、786004、インド

ヘマンガ・ハザリカ、ニールトパル・ゴゴイ、カマルズ・ザマン

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HH と HK は、概念化、方法論、分析、調査、執筆、つまり原案に貢献しました。 VT と JI は蚊のバイオアッセイに貢献し、原稿をレビューしました。 NG は分子インシリコドッキングを実施しました。ウエスタンブロッティングに関する実験はDGが監修しました。 PC と KZ は実験全体を概念化し、監督しました。

Hemanga Hazarika または Pronobesh Chattopadhyay への対応。

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転載と許可

Hazarika, H.、Krishnatreyya, H.、Tyagi, V. 他屋外保護用の蚊よけクリームの製造と評価。 Sci Rep 12、2180 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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受信日: 2021 年 7 月 19 日

受理日: 2022 年 1 月 25 日

公開日: 2022 年 2 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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ナノバイオテクノロジージャーナル (2022)

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