脳血管疾患に対するニトロメマンチンによる薬理学的に標的化されたNMDA受容体拮抗作用

Scientific Reports volume 5、記事番号: 14781 (2015) この記事を引用

4742 アクセス

41件の引用

16 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この記事の訂正は 2016 年 2 月 12 日に公開されました。

この記事は更新されました

脳卒中と血管性認知症は、罹患率と死亡率の主な原因です。神経保護療法が提案されていますが、臨床的に忍容性があり効果的であると証明されたものはありません。 N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（NMDAR）の過剰刺激は脳血管障害の一因と考えられているが、生理機能におけるNMDARの重要性により、少なくとも「大手製薬会社」の多くの人の見解では、この標的がこの標的となっている。この適応症は「治療不可能」です。ここでは、ニトロ基を受容体上の酸化還元媒介調節部位に標的化するために使用される、NMDAR 関連イオンチャネルに結合するアダマンタン部分を含む、新規ニトロメマンチン薬について説明します。ニトロメマンチンは、忍容性が高く、オープンチャネルブロックと受容体のNO/レドックス調節という二重アロステリック機構を介してげっ歯類モデルにおいて脳梗塞に対して効果的です。ニトロメマンチンによる NMDAR の標的 S-ニトロシル化は、低酸素状態によって増強され、それによって虚血ニューロンに向けられます。 NMDAR 活性を調整するアロステリックなアプローチは、脳血管障害の治療の可能性を秘めている可能性があります。

局所脳虚血（脳卒中）と血管性認知症（微小血管系での多発性脳卒中による）は、世界中で重度の認知機能障害と死亡の主な原因となっています1。 N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（NMDAR）の過剰な刺激が脳血管障害の病因に重要であることが認識されている一方で、NMDARアンタゴニストはヒトの脳虚血性傷害に対して効果がないか、臨床的に耐えられないことが以前に判明しています。動物モデルでは初期の有望な結果が得られたにもかかわらず4、5、6。したがって、「大手製薬会社」の多くは、NMDARは脳血管障害に対して「治療可能」ではないという暗黙の仮定を立てている。しかし、標的が難治であるというよりも、使用される特定のアンタゴニストが適切に設計されていない可能性が存在します。ここで提示されたデータは、NMDAR アンタゴニストのケースを再検討する必要があるという前提を裏付けています。

重要な比較的新しい概念の 1 つは、脳虚血や血管性認知症の際に過剰に活性化される NMDAR の集団に関するものです。最近の証拠は、ほとんどの条件下で病理学的活動は主にシナプス外 NMDAR によって媒介されるのに対し、生理学的シナプス NMDAR 活性はニューロンの神経保護分子経路を引き起こすという概念を裏付けています 7,8。特によく研究されている NMDAR アンタゴニストの 1 つであるメマンチン 9 は、競争力のない/速いオフレート (「UFO」) 薬であり、主にシナプス/相活性化 NMDAR よりもシナプス外/強直性活性化 NMDAR に影響を与えます 10、11、12、13。実際、メマンチンは脳卒中の動物研究だけでなく、血管性認知症における有効性に関する第 2 相ヒト臨床試験でも有望であることが示されています 14、15、16、17。それにもかかわらず、この薬は中等度から重度のアルツハイマー病に対してFDAとEMAによって承認されているにもかかわらず、その効果がかなり穏やかであるため、虚血性疾患に対する追加の先進的な試験ではテストされていません。今回我々は、脳虚血の動物モデルにおいて有効性と安全性の両方の向上を実証する硝酸アミノアダマンタンに代表されるメマンチンの改良型類似体を開発し、その特徴を明らかにする。重要なのは、YQW-036/NMI-6979 ニトロメマンチンと呼ばれるリード候補の標的選択性、電気生理学的特性、および神経行動学的効果の詳細な実証により、有望な治療プロファイルが得られることです。初期の薬物動態研究では、この薬剤が脳虚血に関連する疾患の有力な候補となる可能性があることも示されています。

ここで、ニトロメマンチンは、新薬がNMDARで二重の作用部位を示すため、少なくとも部分的にはメマンチンよりも利点があることを示します。したがって、ニトロメマンチンは、局所性脳血管疾患のラットモデルの治療においてメマンチンよりも優れた性能を発揮します。メマンチン部分は、虚血性傷害を受けているニューロンにおいて過剰に開いたNMDAR作動チャネルを優先的に遮断し、NO生成基をこれらのNMDARの酸化還元調節部位に標的化するために使用される。次に、これらの酸化還元部位は S-ニトロシル化を受けてチャネル脱感作を引き起こし、その結果、アロステリック酸化還元調節と結合したチャネル遮断を介してニトロメマンチン薬の二重作用が生じます 11、18、20。結果は、ニトロメマンチンが脳虚血性傷害に対してメマンチンよりも大幅に多くの保護を提供しながら、シナプス伝達のより大きな部分を保護することを示しています。おそらく最も重要なことは、ニトロメマンチンは、作用効果を高めるために同じ受容体に第 2 部分を標的とするために使用される FDA 承認薬 (メマンチン) の一例であるということです。この原理は、CNS における臨床的に許容される創薬のための新しいプラットフォームとして機能する可能性があります。

我々は以前、NMDARがオープンチャネルブロックを介してメマンチンによって拮抗され得ることを示した10,14。また、一酸化窒素（NO）ベースの化合物によってもS-ニトロシル化を受けるアロステリック酸化還元調節部位を介して拮抗できることを示した20,21。、22。さらに、我々は、メマンチンが過剰に（病理学的に）開いた NMDAR 関連チャネルと優先的に相互作用することを実証しました 11,13。さらに、低酸素状態では、NO ベースの化合物が NMDAR のアロステリックシステイン残基と優先的に反応して、過剰な活性を制限します 22。これらの特性を組み合わせて、NO グループを標的にして NMDAR 共役チャネルを病理学的に開く二重機能性薬剤を製造する取り組みにおいて、我々は NOx グループ (x = 1 または 2) であるメマンチンに「便乗」しました。この目的のために、これらの新規薬剤の詳細な構造活性相関 (SAR) を実行するために、最初に数百のニトロメマンチン誘導体 (および制御足場) を合成しました 19。これらのうち、ある一連の薬剤は特に有望であり、橋頭アミン（-NH2）の反対側にニトロ（-NO2）基を有しており、生理的pHでプロトン化（-NH3+）します（図1a、化学物質の詳細については補足方法を参照してください）。合成）18．我々は以前、この橋頭堡アミンを介して、メマンチンがNMDARのMg2+部位またはその近く、特にGluN1（以前はNR1と呼ばれていた）サブユニットに結合することを示した23。

さまざまなアミノアダマンタン薬による NMDAR 媒介電流のチャネル遮断。

(a) アミノアダマンタンおよび硝酸アミノアダマンタンの構造。 1-アミノアダマンタン塩酸塩 (メマンチン) はメチル側鎖 (「R」基) を持ち、分子の後端にニトロ基を含みません。酸化還元機能としてニトロ基を追加すると、NMDAR 関連イオンチャネルに対するアミノアダマンタン部分の親和性が低下します。ただし、「R」側鎖を長くするとこれが補われます。メマンチンと YQW-035 はメチル側鎖を持ちますが、YQW-012 はプロトンのみを持ち、YQW-036 はエチル基、YQW-037 はプロピル基を持ちます。側鎖を長くすると、チャネル内の結合親和性が増加するだけでなく、親油性も増加し、したがって血液脳関門の浸透性も増加し、同時に水溶解度が減少します。 (b) アマンタジン (10 μM) は、定常状態での NMDA 電流阻害が等モルのメマンチンよりも少なくなりました。等モルのニトロメマンチン YQW-035 は、メマンチンよりもチャネル遮断が少ないですが、アマンタジンよりは多くのチャネル遮断を示します。対照的に、ニトロメマンチン YQW-036 はメマンチンとほぼ同程度の定常状態チャネルブロックを示します。保持電位 (Vh) -70 mV での組換え GluN1/GluN2A 受容体を発現する卵母細胞の 2 電極電圧クランプ。値は平均値 + sem (c) Vh = −70 mV でのニトロメマンチン YQW-035 の用量反応。値は平均±標準誤差です。（d）Vh = −70 mVでのニトロメマンチンYQW-036の用量反応。値は平均値±標準誤差です（e）初代ラット皮質ニューロンでは、全細胞パッチクランプ記録により、5μMメマンチンまたはニトロメマンチンYQW-036が-75 mVの両方でほぼ同等の程度の遮断を引き起こし、+30 mVではより低い遮断を引き起こしたことが明らかになりました。これは、メマンチン部分によるブロックの電位依存性を示しています。ヒストグラムでは、各データポイントについて、試験された薬物ごとに n ≥ 5 の記録が行われます。各ペアの左のバーは -75 mV での応答、右のバーは +30 mV の応答です。値は平均値 + sem

我々は、NMDAR上の高親和性メマンチン結合部位を利用して、メマンチン結合部位の外側のS-ニトロシル化/酸化還元部位との相互作用のためにNOx基を標的とする、これらのニトロメマンチン化合物の多くを詳細に研究してきました。特に、ニトログリセリンの-ONO2官能基をメマンチン（化合物YQW-035で表される）に追加することにより、組換えNMDARを発現するカエル卵母細胞からの電気生理学的記録中の定常状態チャネルブロックの効力が低下することを発見しました（図1b）。。私たちは、メマンチンの側鎖を長くすることで、-ONO2 基の追加に関連するチャネルで失われた薬物親和性を補うことができることを発見しました。 YQW-037 (プロピル基あり) は水溶液に溶解できないため、YQW-036 (エチル基あり) は側鎖の好ましい長さを表します。 YQW-35 (メマンチンと同様のメチル側鎖を持つ) および YQW-36 (側鎖がエチルに延長されている) を短期間添加した場合の NMDA 誘導電流阻害の IC50 は、それぞれ 6.3 および 2.4 μM です。、-70 mVの保持電位での電圧クランプ記録中に短期間の薬物添加後の定常状態条件下で測定した場合（図1c、d）。これらの値は、メマンチン (0.5 ～ 1 μM) およびアマンタジン (約 35 μM) の IC50 と比較できます 10,24。したがって、YQW-036 と呼ばれるニトロメマンチン薬剤は、NMDAR で操作されるイオンチャネルに対する親和性がメマンチンのそれに近い親和性を示します。これらの値は細胞外Mg2+の名目上の非存在下で得られたものですが、YQW-036は通常濃度のMg2+の存在下でもNMDA誘発電流をブロックすることを示しました（補足図1）。

さらに、メマンチンと同様に、これらの新しい化合物は、正に荷電したオープンチャネルブロッカーとして予想されるように、ラットの大脳皮質ニューロンからの記録においてNMDA誘発電流の電位依存性阻害を示します（図1e）。しかし、この特性は、メマンチンの臨床効果が比較的弱いことの一部を説明している可能性があります。正に荷電した Na+ および Ca2+ イオンの流入によりニューロンがエネルギー的に損なわれ、その結果脱分極すると、メマンチンはイオンチャネルから反発されます。したがって、神経保護を最も必要とする「最も病気の」ニューロンが脆弱になります。

この欠点を改善する試みとして、ニトロメマンチン付加物は、NMDA 誘導電流の酸化還元に基づく 2 番目の阻害を示します。この追加のアロステリック作用部位は、電位固定卵母細胞の記録で実証されているように、ニトロ基によって媒介されるS-ニトロシル化に起因するNMDARの比較的長期にわたる阻害を引き起こします（図2a）20、27、28。メマンチン部分によるチャネル遮断とは異なり、この 2 番目のアロステリック効果は作用の発現に数分間の薬剤添加を必要とし (したがって、図 1 の短期間の添加では明らかではありません)、ウォッシュアウト後も何分も存続します 20,27,28。オープンチャネルブロッカーに予想されるその後のアゴニスト添加中とは対照的に、ニトロメマンチンがウォッシュアウト期間中にチャネルに入っていないことを確認するために、YQW-036 添加の前後の個々の NMDA 誘発反応の立ち上がり時間を分析しました。アゴニストの添加前にアンタゴニストがすでにチャネル内に存在していない、つまりトラップされている場合に予想されたように、立ち上がり時間が同様であることがわかりました（図2cの挿入図）。さらに、ニトロ基の酸化還元効果とアミノアダマンタンコアのチャネルブロックを 2 つの追加の方法で区別できます。まず、S-ニトロシル化の影響は、5つのシステイン残基の系統的変異によって無効になります（図2b）。重要なことに、これまでの研究により、これらの同じシステイン残基の変異は、チャネル内の Mg2+/メマンチン結合部位での阻害など、NMDAR の他の特性に影響を与えないことが示されています 20,30。ここでテストしたように、周囲空気条件下では、効果の大部分が GluN2A (以前は NR2A と呼ばれていた) サブユニット上の Cys399 によって媒介されることにも注意してください。しかし、以前に実証されたように 22、ニトロ基による阻害は、脳卒中や血管性認知症に関連する低酸素条件下では著しく増加します。これらの条件下では、GluN1 および GluN2 の他の 4 つのシステイン残基が S-ニトロシル化効果に寄与します。第二に、S-ニトロシル化は、チャネルブロックとは異なり、同じシステイン残基と反応してニトロ基の効果を遮断する、メタンチオスルホン酸エチルアンモニウム（MTSEA）などの小分子スルフヒドリル反応性薬剤と事前にインキュベートすることによって防ぐことができます（図） .2c–e)。

S-ニトロシル化を介したニトロメマンチン YQW-036 の酸化還元効果。

(a) 野生型 (WT) またはニトロシル化不可能なシステイン変異体 NMDAR サブユニットを発現する卵母細胞における 2 電極電圧クランプ下の代表的な記録。（b）S-ニトロシル化の阻害効果に対するさまざまなNMDARサブユニットのシステイン残基の寄与の定量化（データは、データポイントあたりn≧5の記録の平均値+標準誤差、**P <0.01）。 (c) 電圧クランプ下での NMDA 誘発電流の卵母細胞記録では、同じシステイン残基が存在する場合に予想されるように、ニトロメマンチン (10 μM) による阻害により、その後のスルフヒドリル反応性試薬 MTSEA (0.5 mM) の適用による追加効果がほとんど遮断されました。関与した。挿入図: ニトロメマンチン添加前後の NMDA 誘発電流の立ち上がり時間を示す拡大時間スケール。 (d) MTSEA による NMDA 誘発電流の阻害により、その後のニトロメマンチンの添加による酸化還元媒介阻害効果が遮断されます。 (e) c および d に示される効果の定量化。データは、データポイントあたり n ≥ 6 卵母細胞の記録の平均 + sem です (*P < 0.005)。 (f) ニトロメマンチンは S-ニトロシル化により NMDAR 活性を阻害します。 100 μM ニトロメマンチン YQW-036 を添加すると、その代謝物メマンチン-OH ではなく、GluN1/GluN2A NMDAR を発現する卵母細胞における NMDA 誘発電流は阻害されました。S-ニトロシル化を観察するために使用される電圧クランプ条件下で記録されました（Vh = −60 mV、データを表す） n ≥ 4 個の卵母細胞の記録)。 (g) NMDAR の GluN1 サブユニット内のメマンチン結合部位の変異により、ニトロメマンチンの酸化還元効果が妨げられます。突然変異GluN1(N616R)によるメマンチン結合部位の破壊は、ニトロメマンチン(100μM)の酸化還元媒介活性を無効にした。 n ≥ 3 の卵母細胞の記録を表すデータ。

NMDAR関連チャネルにおけるメマンチン結合は、例えばGluN1(N616R)/GluN2サブユニット組成を有するNMDARでは、Mg2+部位またはその近くの突然変異によって主に無効になる23,31。我々は、メマンチン結合部位を変異させることにより、チャネル内のメマンチン結合部位の外側のS-ニトロシル化/酸化還元部位にNOxを標的とするコアアミノアダマンタン構造の能力をテストした。チャネルの変異により野生型（WT）NMDARよりも小さな電流が引き起こされるため、これらの実験では効果の大きさを高めるために比較的高濃度（例えば100μM）のニトロメマンチンを使用する必要がありました。我々は、当社のリードニトロメマンチン薬剤である YQW-036 を、ニトロ基を持たない 1-アミノ-3',5'-ジエチル-7-ヒドロキシ-アダマンチン足場 (ここではメマンチン-OH と呼ぶ) と比較しました 18,19。メマンチン結合部位の変異によりニトロメマンチンの活性が大幅に無効になることがわかりました（図2f、gおよび補足図2）が、高濃度のNOドナーS-ニトロソシステイン（SNOC）はWTと変異型NMDARの両方を阻害しました（補足図2)。これらの結果は、アミノアダマンタンコア部分がニトロ基を受容体に向けることができることを示しています。アミノアダマンタン結合部位の変異により、この標的化が妨げられました。

このターゲティングをさらに確認するために、脳卒中を患っているラットにニトロメマンチン YQW-036 を全身投与した後、ビオチンスイッチアッセイを実行して S-ニトロシル化タンパク質を測定しました。ニトロメマンチンは、脳卒中と同側の皮質実質において、NMDARのGluN1サブユニット(SNO-GluN1を形成)のS-ニトロシル化を有意に増加させたが、メマンチンでは生じなかった(図3)。対照的に、神経変性中に異常にニトロシル化されることが示されている他のタンパク質、例えばダイナミン関連タンパク質 1 (Drp1) の S-ニトロシル化は、ニトロメマンチンによって有意な影響を受けませんでした。この実験は、ニトロメマンチンによるニトロ基の病態生理学的損傷部位におけるNMDARへの薬力学的標的化を示している。

S-ニトロシル化は、ニトロメマンチンによって NMDAR を標的とします。

（ a ）自然高血圧ラット（SHR）に、閉塞の2時間後に負荷用量の生理食塩水、ビヒクル、メマンチン（Mem）またはニトロメマンチン（NitroMem）を注射し、その後90分後に屠殺した。脳溶解物を調製し、ビオチンスイッチアッセイを実施して、同側（脳卒中）および対側（非脳卒中）半球の両方からSNO-GluN1およびSNO-Drp1を検出した。（ b ）SNOタンパク質レベルは、ベースライン対照値を上回る同側の対側の結果に対する比として表されます（平均+標準誤差;各値についてn≧4、* t検定による対照と比較してP <0.03）。

ほとんどの NMDAR アンタゴニストは、正常な神経伝達を遮断することによって神経行動異常を引き起こします。ただし、メマンチンにはこれらの副作用は見られません9、11、12、32、33。以前、我々はメマンチンおよびニトロメマンチン薬をラットの海馬自拍標本およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）由来の皮質ニューロンで試験し、それらが神経変性の一因となるシナプス外NMDAR媒介応答を優先的にブロックすることを示した7、13、18。我々は、この点において、ニトロメマンチンの長期添加が等モルのメマンチンよりも効果的であることを報告した18。ここでは、ニトロメマンチン YQW-036 (10 μM) がメマンチンよりも生理学的シナプス活動を大幅に軽減したことを示します (図 4a-c)。さらに、ニトロメマンチンは長期増強（LTP）を免れました（図4d、e）。これは、繰り返しのシナプス入力に応答したシナプス電流の増強を表しており、これは学習と記憶の電気的相関関係であると考えられています。また、メマンチン 34 と同様に、空間学習と記憶の神経行動テストであるモリス水迷路は、神経保護用量のニトロメマンチンの影響を受けませんでした (図 4f) 18、19、35。

EPSC、LTP、モリス水迷路に対するニトロメマンチンの効果の欠如。

(a) 海馬の自動停止から誘発された EPSC の全細胞記録。 EPSC の NMDAR 媒介成分は、10 μM メマンチンよりも 10 μM ニトロメマンチン YQW-036 によってブロックされる程度は低かった。 EPSC の AMPA コンポーネントは 20 μM CNQX でブロックされています。対照として、グルタミン酸結合部位の競合アンタゴニストである 50 μM (2R)-アミノ-5-ホスホペンタン酸 (d-AP5) は、EPSC の NMDAR 成分を完全にブロックしました。 (b) EPSC の遮断の程度は、ニトロメマンチン YQW-036 の存在下で電気刺激を繰り返しても (パルス 1 ～ 10) 有意には増加しませんでした。 (c) メマンチンの阻害効果は使用依存性であり、10 番目に誘発された EPSC が 1 番目よりも多くブロックされました。したがって、等モルのメマンチンは、ニトロメマンチンよりも神経伝達を大幅に遮断します。各パネルのデータは、n ≥ 4 のパッチクランプ記録からの代表値です。（ d ）神経保護用量のニトロメマンチン（NitroMem、10μM）は、ラット海馬スライスの高周波バーストによって誘発された海馬CA1のLTPを阻害しませんでした。（ e ）LTP実験の対照として、MK-801（等モル、10μM）はLTP誘導を完全に阻害しました（パネルdおよびeではn≧4スライス）。 (f) モリス水迷路のパフォーマンスに対するニトロメマンチンの効果の欠如。ニトロメマンチンまたはビヒクルで治療した成体雄自然高血圧ラット（SHR）の水迷路試験。１日目にラットを水迷路に順応させ、次の４日間、１日６回の試行で合計２４回の試行を行った。プラットフォームの位置は毎日変更され、各試行のリリースポイントは擬似ランダムに変化しました。すべての値は平均値±標準誤差です。各グループの n = 5。トライアル 7 と 13 のピークは、テストの 2 日目と 3 日目の最初のトライアルの結果を表しており、動物が一晩の課題に対してある程度の「物忘れ」を示し、再学習する必要があったことを示しています。 4 日目 (試験 19) までに、動物はプラットフォームの新しい位置をより迅速に学習しました。

NMDAR アンタゴニストに関するもう 1 つのよく知られた懸念は、脳の特定の領域に組織学的損傷を引き起こす傾向があることです。たとえば、MK-801 のような高親和性 NMDAR アンタゴニストは、特に発達中のげっ歯類の脳においてニューロンのアポトーシスを引き起こします 36,37。しかし、メマンチンもニトロメマンチンも、臨床的に関連した用量では、発達中の大脳皮質においてニューロンのアポトーシスを誘導しないことがわかりました（補足図3）。

次に、我々は、一過性中大脳動脈閉塞/再灌流（tMCAO/R）からなる局所脳虚血のラットモデルを使用して、ニトロメマンチンの主要薬剤であるYQW-036とメマンチンの神経保護作用をテストしました。このモデルは、我々や他の研究者が詳細に説明しています。以前は34、38、39、40でした。我々は、これらの動物が治療されなければ2日以内に死亡するような非常に重度の脳血管疾患モデルを意図的に選択したことに注意してください。したがって、比較を可能にするために、処置した動物と未処置の動物を、脳卒中１日後に行動学的および組織学的に評価した。最初に、脳卒中後の治療期間を得るために、薬物濃度と送達後の送達時間の完全な用量反応をテストしました。有意な神経保護を得るために、最大実現可能線量 (MFD) を使用すると、閉塞後最大 2 時間 (3 時間ではない) 治療を遅らせることができることがわかりました。したがって、本実験では、負荷用量として以前に決定したメマンチンの MFD (90.3 μmol/kg または 20 mg/kg) 14,34 を使用し、再灌流時に腹腔内 (ip) 投与しました (すなわち、2- h 閉塞後）。ニトロメマンチンの場合、薬物の溶解度の限界により、この負荷用量の約 70% (65.8 μmol/kg) のみが注射されました。その後、標準維持用量の 4.63 μmol/kg (1 mg/kg) メマンチンが 12 時間ごとに投与されました 14,34。一方、ニトロメマンチンの用量はメマンチン維持用量の 70% (3.29 μmol/kg) に維持されました。どちらの薬剤も局所虚血後にかなりの程度の組織学的保護をもたらしました（図5a）。しかし重要なことに、ニトロメマンチン MFD はメマンチン MFD よりも低かったにもかかわらず、運動能力に影響を与える機能的神経行動検査で改善をもたらしたのはニトロメマンチンのみでした (図 5b)。（注：頭蓋および直腸の温度、血圧、代謝パネルなどの生理学的パラメーターは、メマンチンまたはニトロメマンチンの負荷用量によって有意な影響を受けませんでした（補足表1））。

ニトロメマンチンの保護と作用機序。

(a) ニトロメマンチンとメマンチンは、ラット tMCAO/R モデルにおいて組織学的保護を提供します。負荷用量の薬剤（または生理食塩水対照）を閉塞後２時間後に投与し、維持用量を１２時間後に投与し、２４時間目に動物を屠殺した。左: 2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド (TTC) 染色で評価したところ、低用量の YQW-036 (本文を参照) はメマンチンよりも大幅に保護されました (*ポストホックシェフェを用いた ANOVA による P < 0.05) ）。右: 各治療プロトコルにおける代表的な TTC 染色冠状脳切片。 (b) ニトロメマンチンは客観的な神経学的/行動的検査に対して保護効果を示しましたが、メマンチンは示さなかった(実験手順を参照、*事後シェフェを用いた分散分析による P < 0.05)。パネル a および b で試験した自然発症高血圧ラット (SHR) の数: 生理食塩水グループでは n = 9。メマンチン治療群の場合は n = 4。ニトロメマンチン治療群では n = 5。 (c) ニトロメマンチン治療は、メマンチン、メマンチン-OH、およびビヒクル対照と比較して梗塞サイズを縮小しました(**事後シェフェを用いたANOVAによるP < 0.01)。テストされた SHR の数: 生理食塩水グループでは n = 13。メマンチン治療群の場合は n = 10。ニトロメマンチン治療群の場合は n = 8。メマンチン-OH-処理グループの場合、n = 7。値は各パネルの平均値±標準誤差です。 (d) ニトロメマンチンの作用の概略図。アダマンタン部分は、NOx 基 (x = 1 または 2) を NMDAR に標的化して送達し、2 つのアンタゴニスト作用部位を提供します。まず、メマンチンなどのアダマンタンが過剰に開いた NMDAR 共役チャネルに入り、優先的に結合します。第二に、NOx 基は、チャネルの電圧場の外側で、反応性チオール基で構成される酸化還元部位と反応します (参考文献 12 から修正)。

次に、直接比較を可能にするために、ニトロメマンチンの MFD を使用して、等モル濃度のメマンチン、ニトロメマンチン、およびその分解生成物であるメマンチン-OH をテストしました。メマンチンおよびメマンチン-OHはこの用量では有意な保護をもたらさないのに対し、ニトロメマンチンは組織学的分析において有意な利益をもたらすことを観察しました（図5c）。総合すると、これらの発見は、ニトロメマンチンが局所的な脳血管障害に対してメマンチンよりも優れた結果をもたらし、この追加の利点はニトロ基の標的送達に起因する可能性があり、NMDARのアロステリック制御の改善をもたらすという考えと一致します。

本研究では、NMDARでの二重部位の低酸素調節拮抗作用を提供するニトロメマンチンの作用機序について説明します（図5d）。虚血ニューロンに利益をもたらす可能性のあるニトロメマンチンの特徴は次のとおりです。 1. 過度に開いた、主にシナプス外の NMDAR チャネルを電位依存的に遮断します。 2. メマンチン足場によるニトロ基の NMDAR への標的送達。低酸素によるチャネルS-ニトロシル化のアロステリック制御。ニトロ基の標的化は、オープンチャネルブロッカーがチャネル口付近で過ごす時間の割合が増加し、それによってニトロ基が隣接するシステイン残基と反応する統計的確率が増加するため、おそらく起こります。したがって、ニトロメマンチンは、チャネル内のメマンチン作用とチャネル外の S-ニトロシル化によって表される、NMDAR41 に 2 つのアロステリックな「ボリューム制御」を提供することにより、チャネル活性の「ゲイン」の生物物理学的パラメータを調節します。このようにして、過剰なシナプス外 NMDAR 活性は、メマンチン単独よりもニトロメマンチンによってより効果的にダウンレギュレートされます 11、18、20、23、32。

チャネルの S-ニトロシル化が正確にどのように起こるかは不明です。ニトロメマンチンなどの硝酸アルキルは直接ニトロソ化せず、自発的に NO を放出しません。ただし、それらはチオールとの反応でチオ硝酸塩を形成し、それが再配列してニトロソ化スルフェニル亜硝酸塩を形成する可能性があります。さらに、受容体のシステインネットワークは、必要とされる還元化学を促進する可能性があります21、27、42。結局のところ、ニトロ基の作用部位はチャネルの電圧場の外部にあるため、ニューロンが脱分極しても、NMDAR拮抗作用への酸化還元の寄与は減少しません20、22、28。したがって、ニトロメマンチンは、メマンチン単独では有効性が失われる時点で過剰な NMDAR 活性を下方制御することができます。

ニトロ基は、アミノアダマンタン部分によるオープンチャネル遮断期間中、すなわちアゴニストの存在下でのみ、ＮＭＤＡＲを標的とすることが予想されるかもしれない。しかし、興味深いことに、NMDAアゴニストの適用の間に薬剤を長期間添加した場合でも、ニトロメマンチンの酸化還元媒介効果が観察されました。これらの結果は、脂質と水の分配係数が非常に高いアミノアダマンタンの既知の物理化学に基づいて理解できます (参考文献 35 の補足情報およびその引用を参照)。我々が観察したメマンチンに比べてニトロメマンチンの水溶解度の低下は、ニトロ基が追加されると親油性がさらに増加することを示しています。したがって、アミノアダマンタン硝酸塩はリザーバーのように脂質膜内に留まり、チャネルが開くとすぐにチャネルに入り、酸化還元効果を開始する準備が整っていると考えられます 35。アンタゴニスト適用の前後でアゴニスト誘導電流の立ち上がり時間が同様であるため、YQW-036はNMDA適用前にチャネルに入っていないことがわかります（図2c、挿入図）。 NMDA 適用前に硝酸アミノアダマンタンがすでにチャネル内に存在していた場合 (つまり、閉じたチャネル内にトラップされていた場合)、アゴニスト適用直後に硝酸アミノアダマンタンがゆっくりと出てきて、NMDA 誘発電流の立ち上がり時間が遅くなったでしょう 10,29。さらに注目すべきことに、高濃度の YQW-036 を使用した場合 (1 ～ 10 μM ではなく 100 μM)、アゴニストの繰り返しによる阻害効果の成分のゆっくりとした洗い流しで明らかなように、薬物の親油効果はさらに増大しました。アプリケーション (図 2f)。それにもかかわらず、YQW-036 の持続効果が MTSEA の事前の添加または NMDAR の酸化還元活性システインの変異によって大幅に無効になったという事実は、薬物の阻害作用のこの成分が親油性の増加のみに起因するものではないことを示しています。むしろ、YQW-036 の長期阻害効果の主要な要素は、受容体の酸化還元調節の基礎となるシステイン残基での化学的介入と分子的介入の両方によって妨げられるため、NMDAR 上の酸化還元部位での相互作用によって最もよく説明されます 20 。さらに、チャネル内のアミノアダマンタン部分の主要結合部位（GluN1（N616R））の変異により、YQW-036の長期阻害効果が大幅に無効になったという発見（図2g）は、メマンチン様作用がメマンチン様作用を引き起こすという考えと一致しています。薬物の作用により、ニトロ基が受容体に到達します。ニトロメマンチンによる S-ニトロシル化により、アダマンタン部分を介したチャネル遮断に対する受容体の感受性も増加するというさらなる可能性も排除できません。さらに、アミノアダマンタン硝酸塩の親油性特性は、血液脳関門を透過する薬物の濃度を増加させるという点で臨床的に有益であるはずである。実際、アミノアダマンタンはその親油性により、脳内で血漿レベルの少なくとも 20 倍濃縮されることが報告されています (参考文献 35 の引用を参照)。

我々は以前、メマンチンのオフレートが比較的速いため、メマンチンがシナプスのNMDAR関連チャネルに蓄積しないという証拠を発表していた。したがって、メマンチンは、興奮性シナプス後電流 (EPSC) の NMDAR 媒介成分、LTP の NMDAR 依存性誘導、またはモリス水迷路などの行動テストに悪影響を及ぼしません 10,23,32。メマンチンがシナプス外/持続的に活性なNMDARをブロックしながら、シナプス/相性活性をほとんど回避するという事実は、ヒト臨床試験におけるメマンチンの臨床忍容性と妥当な臨床有効性の基礎となっていると考えられています11、12、13。したがって、ニトロメマンチンがメマンチンよりもさらに大きな程度でシナプス外活動に拮抗しながら、より多くのシナプス活動を免れるという我々の発見は、新薬の有効性の増加の説明となり、ヒト試験における臨床忍容性の良い前兆となる可能性がある18。さらに、NO ベースの化合物 22 で見られるように、受容体阻害の低酸素増強は虚血において特に望ましい特徴です。したがって、低酸素調節性のアロステリック標的 NMDAR アンタゴニストは、親和性は低いものの、脳血管障害やその他の神経変性障害に対して有望である可能性があります 18,19。

脊椎動物の使用に関するすべてのプロトコールは、Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute IACUC によって承認され、すべての実験は ARAC ガイドラインに従いました。他の方法および関連する参考文献は、この論文のオンライン版に記載されています。

公開されている反応を使用して硝酸アダマンタンを合成しました。合成スキームと手順は補足方法に記載されています。

NMDAR サブユニットの注射後 2 ～ 7 日後に、カエルのリンゲル液中の卵母細胞に対して、-60 または -70 mV での 2 電極電圧クランプ記録を作成しました。記録は、MacLabバージョン3.5ソフトウェア（AD Instruments、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、Oocyte Clamp OC-725b増幅器（Warner Instrument Corporation、コネチカット州ハムデン）を用いて室温で実施した。電流注入電極の抵抗は 0.5 ～ 1 MΩ、電圧検出電極の抵抗は 1 ～ 4 MΩ でした。両方の電極に 3 M KCl を充填しました。 90 mM NaCl、1 mM KCl、10 mM HEPES、1.5 mM BaCl2、および 10 ～ 100 μM グリシンを含む溶液 (pH 7.5) を使用して、卵母細胞を連続的に灌流しました。 Ca2+活性化Cl-電流の二次活性化を最小限に抑えるために、カルシウムではなくバリウムを二価陽イオンとして使用しました43。いくつかの実験では、1.2 mM MgCl2 を浴溶液に添加しました。薬物をカエルのリンゲル液に溶解し、2 ml/分の流速で灌流することによって適用した。場合によっては、比較的迅速な溶液交換を実現するために、パッチクランプ記録で使用される「下水道管」システムに似た一連のピペットを使用しました44。灌流アーチファクトはトレースからデジタル的に除去されました。

確立された方法を使用して、ラットの大脳皮質初代培養物および海馬の自動培養物を調製した45、46、47。簡単に説明すると、ラットの皮質培養では、胎生 16 ～ 17 日 (E16 ～ 17) の Sprague-Dawley ラットから大脳皮質を解剖しました。解離後、細胞をDMEMおよびハムF12および10％熱不活化鉄補充子ウシ血清を加えたポリ-L-リジンでコーティングした皿上に播種した。培養物は、NMDAR の完全なレパートリーが発現されていることを確認するために、使用前に少なくとも 3 週間、5% CO2/95% 空気の加湿雰囲気中で 37 °C でインキュベートされました。自動培養では、生後 0 日目 (P0) にラットの初代海馬細胞を採取し、単細胞懸濁液を調製し、ドット状の初代ラット星状細胞マイクロアイランド上にプレーティングしました。マイクロアイランドは、アストロサイトの単細胞懸濁液を、アガロースでコーティングされたカバーガラス上のコラーゲン（62.5μg/ml）/ポリ-D-リジン（50μg/ml）マイクロドット上にプレーティングすることによって調製した。皮質培養の場合、培養中の自発的活動を排除するために、1 μM テトロドトキシン (TTX) で灌流した後、ニューロンに対して全細胞記録を一般に実行しました。自動培養では、1 つ以上の星状膠細胞のマイクロアイランド上で成長する単一ニューロンから全細胞記録が得られました。記録は、パッチクランプ増幅器 (Axopatch 200B または MultiClamp 700A Molecular Devices、カリフォルニア州ユニオンシティ) を使用して、インビトロ (DIV) で 14 ～ 26 日間培養したものを室温で実行しました。培養ニューロンを、HEPES緩衝外部溶液(mM):NaCl、146;2ml/分の速度で灌流した。 KCl、2.5; CaCl2、2; HEPES、10; d-グルコース、20; pH 7.4 (NaOH 調整)、300 ～ 310 mOsm。ホウケイ酸ガラスキャピラリー (GC150F-10、Warner Instruments) を使用して、マイクロピペットプーラー (P87、Sutter Instruments、カリフォルニア州ノヴァト) を使用してパッチピペットを引っ張りました。オープンチップ抵抗は、内部溶液 (mM): CsCl、140 で 2 ～ 7 MΩ でした。ＮａＣｌ、４； CaCl2、0.5; HEPES、10; Na-GTP、0.5; Mg-ATP、2; EGTA、5; pH 7.33 (CsOH調整済み); 315mOsm。一部の実験では、Cs-グルコン酸ベースの細胞内溶液（mM）を使用しました。Cs-グルコン酸、117; ＮａＣｌ、９； HEPES、10; およびMgCl2、2; EGTA、10; pH 7.2 (NaOH調整済み)。 NMDAR 媒介電流は、細胞外マグネシウムの非存在下および 10 ～ 20 μM グリシン存在下で記録されました。薬剤は、高速バルブ制御灌流システム (Lee Company、エセックス、コネチカット州) によって投与されました。特に明記しない限り、すべてのアンタゴニストは Tocris Bioscience (Ellisville, MO) から購入しました。データは、ＰＣｌａｍｐｖ．１０ソフトウェア（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ユニオンシティ、カリフォルニア州）を使用して、フィルタリングおよびデジタル化された電気信号として取得および分析された。データは、統計ソフトウェアパッケージ Origin 7 (OriginLab Corporation、マサチューセッツ州ノーサンプトン) を使用して表示および分析されました。

突然変異体ＮＭＤＡＲサブユニットは、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の指示に従って使用して調製した。コード領域全体の配列を決定して、変異を確認しました。

成体雄自然高血圧ラット(SHR)をPBSまたはニトロメマンチン(65.8μmol/kgの負荷用量、腹腔内、その後12時間ごとに3.29μmol/kgの維持用量)で処理した。各グループは 5 匹のラット (n = 5) で構成されました。両方のグループの治療は、試験初日の 48 時間前に開始されました。治療と水迷路試験は両方とも盲検法で実施されました。水迷路は直径 150 cm、深さ 85 cm の円形のプールで構成されていました。プールは黒色の可動プラットフォームを覆うように 1 cm の水で満たされました。水は黒色の塗料を加えて不透明にし、5 日間のテストの間室温 (20 ～ 23 °C) に維持しました。白いプールと黒い水により、ビデオカメラは最大限のコントラストで白いネズミを追跡することができました。 1日目に、ラットを台のないプールに60秒間順応させた。 2 日目から 5 日目までをテストに使用しました。 2 日目から開始して 5 日目まで、ラットを合計 24 回の試行 (1 日あたり 6 回の試行) にわたって、水没したプラットフォームを見つけて到達する訓練を行いました。プラットフォームは、各セッション (日) のすべてのトライアルで同じ場所に維持されましたが、事前に決定された順序でセッションごとに変更され、合計 4 つの固有の場所が得られました。さらに、放出可能な場所は 4 つありました (プールの周囲にある 4 つの基本的なコンパスの方向)。各動物のセッション当たり 1 日あたり 6 回の試験を、異なる場所からペアで実施し、別のペアの試験に進む前にすべての動物を検査しました。さらに、ドロップ位置の順序はすべてのラットで一定でしたが、プラットフォームと同様に、セッションごとに変わる疑似ランダムな順序がありました。各水迷路テストセッションは、個々の試行間または試行ペアのラウンド間に大きな時間差を設けることなく、連続的に実施されました。ラットがプラットフォームに正常に到達するまでの最大許容時間は 120 秒でした。動物がその時間内にプラットフォームに到達しなかった場合は、手動で誘導され、120 秒の時間が与えられました。 2 つの試験の間、ラットは最低 5 秒間プラットフォーム上に留まりました (この期間は試験期間の決定には除外されました)。

成体ラット (275 ～ 300 g) を断頭して屠殺しました。脳を頭蓋骨から迅速に取り出し、冷人工脳脊髄液 (ACSF) (mM: NaCl 116; mM) に入れました。 KCl 5.37; ＮａＨＰＯ４１．０２； NaHCO3 26.19; CaCl2 3.2; MgSO4 0.8; d-グルコース 10、pH 7.4、泡立った 95% O2/5% CO2 で飽和、6 °C。海馬を手動組織チョッパー (Stoelting) によって 40 μm の厚さにスライスしました。使用されたスライスは、海馬の中央 3 分の 1 からのもので、中隔側頭軸に垂直な平面に向けられていました。スライスを冷ACSF中でフロースルーインターフェイスチャンバーに移し、33.5℃で灌流しました。 ACSF と空気界面は 95% O2/5% CO2 の泡立ちガスで飽和されました。 30分間のインキュベーション後、液体をMK-801、メマンチンまたはニトロメマンチンの有無にかかわらず新鮮なACSFと交換し、電気生理学的記録の前にさらに60分間インキュベートした。

細胞外場興奮性シナプス後電位（EPSP）は、我々が以前に公開したプロトコルに従って、CA3 シェーファー側枝を刺激した後、海馬の CA1 領域の放射状層で記録されました。記録は、ASCF (抵抗 1 ～ 2 MΩ) を充填したガラス微小電極を使用して実行されました。刺激には双極タングステン電極 (Fred Haer) を使用しました。反応は AC アンプ (AM Systems) で監視されました。記録電極を、放射状層の表面下約100μmの深さ、かつ刺激電極から1000μmの位置に配置した。フィールド EPSP が誘発され、入力/出力曲線が生成されて、最大の半分の応答を誘発するために必要な刺激強度が決定されました。後続の刺激はこの強度で送達されました。ペアパルス刺激は 6 ～ 200 ms の刺激間間隔で送達され、各間隔でペアパルスの抑制または促進の程度が計算されました。 EPSP の傾き値は、ペアパルス試験パラダイムで使用されました。スライスへの損傷を防ぐために、スライスごとに電極を 1 つだけ配置しました。 10 ～ 20 分間、ベースライン応答を 30 秒ごとに記録しました。安定したベースラインを観察した後、スライスに強縮性刺激を適用し（100 Hz バーストを 1 秒間）、30 秒ごとに 60 ～ 90 分間適用しました。破傷風後の EPSP 勾配の変化率を破傷前のベースラインと比較しました。反復測定 ANOVA を使用して、異なるグループの傾きを比較しました。

ラット脳における NMDA 受容体の S-ニトロシル化の分析は、以前に記載されているように、ビオチンスイッチアッセイによって実行されました 48,49。組織溶解物中の遊離チオールはメチルメタンチオスルホネートでブロックされました。次いでタンパク質をアセトンで沈殿させ、HEN緩衝液(250mM HEPES、pH 7.4、1mM EDTA、0.1mMネオクプロイン)+1%ドデシル硫酸ナトリウムに再懸濁した。アスコルビン酸塩を使用してニトロソチオールを選択的に還元し、遊離チオール基を再形成し、その後、1 mM ビオチン-HPDP (Pierce、イリノイ州ロックフォード) を使用してビオチン化しました。ビオチン化バンドの特異性を確保するために、対照としてアスコルビン酸塩を使用せずに並行反応を実行しました。ビオチン化タンパク質はストレプトアビジン-アガロースビーズ上に捕捉され、イムノブロッティングによって分析されました。

生後7日のラットにビヒクル、MK-801、メマンチンまたはニトロメマンチンを腹腔内注射し、24時間後にTUNEL（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンド標識）によって脳を検査してアポトーシス細胞を検出した。定量化は、光学ディセクターおよびフラクショネーター法 (Cruz-Orive および Weibel、1990) を使用して実行されました。簡単に言うと、高開口の対物レンズと計数フレーム (0.05 mm x 0.05 mm、ディセクターの高さ 0.07 mm) を使用して、ニューロンを視覚化し計数しました。不偏サンプリングは、光学ディセクター法を使用して、さまざまな焦点レベルで計数フレーム内の 8 ～ 10 の視野をランダムに選択することによって実行されました。正常なニューロンの密度は、ニッスル染色（メチレンブルー、アズール II）で染色した厚さ 70 μm の切片内のニューロンを計数することによって決定されました。計数は盲検法で実施した。

ヒトの高血圧患者と同様に脳卒中を起こす傾向が知られているため、本発明者らは高血圧自然発症ラット（SHR、Harlan）を使用し、管腔内縫合法でtMCAO/Rを誘導した34、38、39、40。麻酔薬気化器と流量計を使用して、200 ～ 300 g の男性 SHR を 30% 酸素/70% 亜酸化窒素中の 3% イソフルランで麻酔しました。恒温温度システムを使用して体温を 37 °C に維持しました。レーザードップラーモニターを使用して、外科手術中および回復中の相対脳血流（rCBF）をモニタリングしました。 rCBF測定は、麻酔直後、MCA閉塞後、再灌流を開始するために縫合糸を抜く直前および直後に測定した。脳卒中を開始するために、正中線切開を行って、右総頚動脈、外頚動脈、および内頚動脈を露出させた。外頸動脈の後頭動脈枝を分離し、末端舌側および上顎動脈枝とともに電気焼灼ユニットで凝固させた。内頸動脈を分離し、隣接する迷走神経から注意深く分離しました。翼口蓋動脈をその起始部近くで結紮し、２本の緩く結んだ縫合糸を外頚動脈断端の周囲に配置し、微小動脈瘤クリップを内頚動脈との分岐点付近の外頚動脈に適用した。外頸動脈に小さな穿刺開口部を作り、その開口部を通してモノフィラメント（管腔内縫合糸）を挿入し、フィラメントを含む管腔の周りで縫合糸を締めた。微小動脈瘤クリップを外頚動脈から取り外し、モノフィラメントを外頚動脈の内腔から内頚動脈内に、血流が低下するまで総頚動脈の分岐点を越えて約 19 ～ 20 mm の距離だけゆっくりと前進させました。 (rCBF 測定により ≥80% 減少)。出血を防ぐために、外頸動脈断端の周囲の縫合糸をきつく締めました。 2 時間後、縫合糸が除去され、フィラメントが引き抜かれ、縫合された切開部が除去され、rCBF は再灌流時に少なくとも 75% 回復しました。再灌流の直前に、ラットにメマンチン、ニトロメマンチン、またはメマンチン-OHを生理食塩水ビヒクルまたは等量のビヒクル単独で腹腔内注射により投与した。初期実験では、各薬物の負荷用量は 20 mg/kg で、メマンチンの場合は 90.3 μmol/kg、ニトロメマンチン YQW-036 の場合は 65.8 μmol/kg に相当します（ニトロメマンチンは溶解度が低いため、約 30% 低い用量が必要でした）水溶液中）。維持用量（メマンチン4.63μmol/kgおよびニトロメマンチン3.29μmol/kg、それぞれ1mg/kgに相当）を負荷用量の12時間後に投与した。以前に実証されたように、この用量のメマンチンは、NMDAR 関連イオンチャネルの入り口で 5 ～ 10 μM の生物学的に有効な神経保護濃度を生成します 35。その後の実験では、上記のより低いニトロメマンチン用量を使用して、等モルのメマンチン、ニトロメマンチン YQW-036、またはメマンチン-OH を使用しました。齧歯動物を閉塞後 24 時間で屠殺し、脳梗塞のサイズを 2,3,5-トリフェニル-2H-塩化テトラゾリウム (TTC) 染色によって組織学的に評価しました 50。

各成体動物は、フィラメント除去直後と、再灌流の 1 日後 (屠殺前) に再度神経学的評価 51 を受けました。各動物には 0 ～ 4 の客観的行動スコアが割り当てられました。0 は観察可能な神経学的欠陥がないことを示します。 1 左前足を伸ばすことができない。 2 左に旋回します。 3 左に落ちる。 4 自発的に歩くことができない。脳卒中後 24 時間で得られたスコアを各治療グループの各時点で平均し、神経学的スコアとして提示しました。

電気生理学的および組織学的実験の値は、平均±標準誤差として表示されます。グループ間の統計的差異を検定するために、二元比較にはスチューデントの t 検定（両側）を使用し、多重比較には事後検定を含む ANOVA を使用しました。行動テストの場合、ノンパラメトリックテスト (マン-ホイットニー-U テスト) により、さまざまな条件下での差異の有意性が評価されました。 P < 0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。

この論文の引用方法：Takahashi, H. et al. 脳血管疾患に対するニトロメマンチンによる薬理学的に標的化されたNMDA受容体拮抗作用。科学。議員 5、14781; 土井: 10.1038/srep14781 (2015)。

修正が公開され、このペーパーの HTML 版と PDF 版の両方に追加されています。論文では誤りが修正されています。

ロー、EH 2013 年トーマスウィリス賞講演: 脳卒中研究の因果関係と協力。ストローク 45、305–308 (2014)。

記事 Google Scholar

Simon, RP、Swan, JH、Griffiths, T. & Meldrum, BS N-メチル-D-アスパラギン酸受容体の遮断は、脳の虚血性損傷を防ぐ可能性があります。サイエンス 226、850–852 (1984)。

記事 CAS ADS Google Scholar

チェン、H.ら。虚血性脳損傷における酸化ストレス: 細胞死のメカニズムと神経保護の潜在的な分子標的。酸化防止。レドックス。信号。 14、1505–1517 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Dirnagl, U.、Iadecola, C.、Moskowitz, MA 虚血性脳卒中の病態生物学: 統合された見解。トレンド神経科学。 22、391–397 (1999)。

記事 CAS Google Scholar

Kemp, JA & McKernan, RM 薬物標的としての NMDA 受容体経路。ナット。神経科学。 5 補足、1039–1042 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Tymianski, M. 脳虚血における細胞シグナル伝達の破壊の新たなメカニズム。ナット。神経科学。 14、1369–1373 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Hardingham, GE & Bading, H. シナプスとシナプス外の NMDA 受容体シグナル伝達: 神経変性疾患への影響。ナット。神経科学牧師。 11、682–696 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

パーソンズ MP およびレイモンド LA 中枢神経系障害におけるシナプス外 NMDA 受容体の関与。ニューロン 82、279–293 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Rogawski, MA & Wenk, GL アルツハイマー病の治療におけるメマンチン使用の神経薬理学的根拠。 CNS Drug Rev. 9、275–308 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Chen, HS & Lipton, SA ラット網膜神経節細胞における NMDA 活性化チャネルのメマンチン遮断のメカニズム: 非競合的拮抗作用。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 499 (Pt 1)、27–46 (1997)。

記事 CAS Google Scholar

サウスカロライナ州リプトン NMDA 受容体遮断による神経保護のパラダイムシフト: メマンチンとその先へ。ナット。 Rev.DrugDiscov. 5、160–170 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

リプトン、SA 神経保護のための病理学的に活性化された治療法。ナット。神経科学牧師。 8、803–808 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Xia, P.、Chen, HS、Zhang, D. & Lipton, SA メマンチンは、海馬の自閉症におけるシナプスの NMDA 受容体電流よりもシナプス外の NMDA 受容体電流を優先的にブロックします。 J. Neurosci. 30、11246–11250 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、HS 他メマンチンによる N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 応答のオープンチャネル遮断: NMDA 受容体媒介神経毒性に対する治療上の利点。 J. Neurosci. 12、4427–4436 (1992)。

記事 CAS Google Scholar

Erkinjuntti, T.、Roman, G.、Gauthier, S.、Feldman, H. & Rockwood, K. 血管性認知症および血管性認知障害の新しい治療法。脳卒中 35、1010–1017 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Orgogozo, JM、Rigaud, AS、Stoffler, A.、Mobius, HJ & Forette, F. 軽度から中等度の血管性認知症患者におけるメマンチンの有効性と安全性：ランダム化プラセボ対照試験（MMM 300）。脳卒中 33、1834 ～ 1839 年 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Shih、AY 他最小の脳卒中: 1 本の貫通血管の閉塞は、梗塞と認知障害を引き起こします。ナット。神経科学。 16、55–63 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

タラントヴァ、M.ら。Ａβは、アストロサイトのグルタミン酸放出、シナプス外のＮＭＤＡ受容体の活性化、およびシナプスの喪失を誘導する。手順国立アカド。科学。 USA 110、E2518–2527 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Wang, Y. et al. アミノアダマンタン硝酸塩の薬理学。カー。アルツハイマー病研究所 3、201–204 (2006)。

記事 ADS Google Scholar

チョイ、YBら。 S-ニトロシル化によるNMDA受容体共役イオンチャネル調節の分子基盤。ナット。神経科学。 3、15–21 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Lipton, SA & Stamler, JS NMDA 受容体における一酸化窒素の酸化還元関連同族体の作用。神経薬理学 33、1229–1233 (1994)。

記事 CAS Google Scholar

高橋洋ほか低酸素症は、チオール酸素センサーモチーフを介して S-ニトロシル化媒介 NMDA 受容体阻害を強化します。ニューロン 53、53–64 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Chen, HS & Lipton, SA メマンチンと N-メチル-D-アスパラギン酸ゲートチャネルとの相互作用の 2 つの異なる機構の薬理学的意味。Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．経験値それで。 314、961–971 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Blanpied、TA、Clarke、RJ & Johnson、JW アマンタジンは、チャネル遮断中のチャネル閉鎖を促進することによって NMDA 受容体を阻害します。 J. Neurosci. 25、3312–3322 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Silver, IA & Erecinska, M. in vivo ラット脳の低酸素および虚血における [Ca2+] の細胞内および細胞外の変化。 J. Gen. Physiol. 95、837–866 (1990)。

記事 CAS Google Scholar

Wollmuth, LP、Kuner, T.、Seeburg, PH & Sakmann, B. 組換え NMDA 受容体チャネルの選択性フィルターに対する NR1 サブユニットと NR2A サブユニットの異なる寄与。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 491 (Pt 3)、779–797 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

リプトン、SA et al. 一酸化窒素および関連ニトロソ化合物の神経保護効果および神経破壊効果の酸化還元に基づくメカニズム。 Nature 364、626–632 (1993)。

記事 CAS ADS Google Scholar

リプトン、SA et al. タンパク質機能のシステイン制御 - NMDA 受容体調節によって例示される。トレンド神経科学。 25、474–480 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Blanpied、TA、Boeckman、FA、Aizenman、E. & Johnson、JW アマンタジンおよびメマンチンによる NMDA 活性化応答のトラップチャネルブロック。 J. Neurophysiol. 77、309–323 (1997)。

記事 CAS Google Scholar

Choi, Y.、Chen, HV & Lipton, SA 3 対のシステイン残基は、nmda 受容体の酸化還元と zn2+ 調節の両方を媒介します。 J. Neurosci. 21、392–400 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

Kotermanski、SE、Wood、JT & Johnson、JW NMDA 受容体の表面部位に結合するメマンチンは、部分的なトラップに寄与します。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 587、4589–4604 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Chen, HS & Lipton, SA 臨床的に許容される NMDA 受容体拮抗薬のケミカルバイオロジー。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． 97、1611–1626 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Parsons, CG、Stoffler, A. & Danysz, W. メマンチン: グルタミン酸作動性システムの恒常性の回復によって記憶力を改善する NMDA 受容体拮抗薬。活性化が少なすぎると悪影響があり、多すぎるとさらに悪影響を及ぼします。神経薬理学 53、699–723 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、HS 他神経保護濃度の N-メチル-D-アスパラギン酸オープンチャネルブロッカーであるメマンチンは、虚血後投与後の細胞質空胞化を起こさずに効果があり、迷路学習や長期増強を阻害しません。神経科学 86、1121–1132 (1998)。

記事 CAS Google Scholar

岡本伸ほかシナプスとシナプス外の NMDA 受容体活性のバランスは、変異体ハンチンチンの封入体と神経毒性に影響します。ナット。医学。 15、1407–1413 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Ikonomidou, C. et al. 発達中の脳における NMDA 受容体の遮断とアポトーシス性神経変性。サイエンス 283、70–74 (1999)。

記事 CAS ADS Google Scholar

オルニー、JWら。発達中の脳における薬物誘発性のアポトーシス性神経変性。脳病理。 12、488–498 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Gu、Z.ら。マトリックスメタロプロテイナーゼ-9 の高度に特異的な阻害剤は、一過性局所脳虚血においてラミニンをタンパク質分解から救い出し、ニューロンをアポトーシスから救い出します。 J. Neurosci. 25、6401–6408 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Gu、Z.ら。マトリックスメタロプロテイナーゼの S-ニトロシル化: 神経細胞死に至るシグナル伝達経路。サイエンス 297、1186–1190 (2002)。

記事 CAS ADS Google Scholar

王、YFら。組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) は、野生型マウスおよび tPA 欠損マウスにおける局所脳虚血後の神経損傷を増加させます。ナット。医学。 4、228–231 (1998)。

記事 CAS Google Scholar

サウスカロライナ州リプトン断るが、断るわけではない。ネイチャー 428、473 (2004)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Ishiropoulos, H. et al. スーパーオキシドジスムターゼによって触媒されるペルオキシ亜硝酸媒介チロシンニトロ化。アーチ。生化学。生物物理学。 298、431–437 (1992)。

記事 CAS Google Scholar

Leonard, JP & Kelso, SR アフリカツメガエル卵母細胞における NMDA 応答の明らかな脱感作には、カルシウム依存性の塩化物電流が関与しています。ニューロン 4、53–60 (1990)。

記事 CAS Google Scholar

Vyklicky, L., Jr.、Benveniste, M. & Mayer, ML マウス培養海馬ニューロンにおけるグリシンによる N-メチル-D-アスパラギン酸受容体脱感作の調節。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 428、313–331 (1990)。

記事 CAS Google Scholar

Bekkers, JM & Stevens, CF 細胞培養で維持された単離された海馬ニューロンにおける興奮性および抑制性のオータプシス電流。手順国立アカド。科学。 USA 88、7834–7838 (1991)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Segal, MM 1 つの興奮性海馬ニューロンを含む微小培養物におけるてんかん様活性。 J. Neurophysiol. 65、761–770 (1991)。

記事 CAS Google Scholar

Segal、MM および Furshpan、EJ 少数の海馬ニューロンを含むマイクロ培養物におけるてんかん様活性。 J. Neurophysiol. 64、1390–1399 (1990)。

記事 CAS Google Scholar

Jaffrey, SR & Snyder, SH S-ニトロシル化タンパク質を検出するためのビオチンスイッチ法。科学。 STKE 2001、pl1 (2001)。

CAS PubMed Google Scholar

上原哲他 S-ニトロシル化タンパク質-ジスルフィドイソメラーゼは、タンパク質のミスフォールディングを神経変性に結び付けます。 Nature 441, 513–517 (2006)。

記事 CAS ADS Google Scholar

ベダーソン、JB et al. ラットにおける実験的脳梗塞の検出および定量化のための染色剤としての 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリドの評価。脳卒中 17、1304 ～ 1308 年 (1986 年)。

記事 CAS Google Scholar

マッケンセン、GB 他メタロポルフィリン触媒性抗酸化物質の虚血後遅延投与による神経保護。 J. Neurosci. 21、4582–4592 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

ニトロメマンチンシリーズの薬剤の初期誘導体に関する予備実験を行ってくれたMark Washburn氏、治療的アロステリック制御のアイデアへの最初の貢献、この化合物クラスの設計と原稿執筆の協力してくれたJonathan Stamler氏、薬剤開発の支援をしてくれたGreg Went氏に感謝します。 Traci Fang Newmeyer と Ravi Agarwal には優れた技術サポートを提供していただきました。この研究は、NIH助成金P01 HD29587、R01 EY05477、R21 NS080799およびP30 NS076411、国防総省（陸軍）助成金W81XWH-13-0053（SALへ）、米国心臓協会博士研究員フェローシップ09POST2120061（PXへ）によって部分的に支援されました。）およびAdamas Pharmaceuticals, Inc.からの企業スポンサー研究契約による。

マリア・タラントヴァ、エミリー・A・ホランド、中西伸樹、スコット・R・マッカーチャー、中村知宏、スチュアート・A・リプトン

現在の住所: 神経変性疾患センター、シンティロン研究所、サンディエゴ、カリフォルニア州、92121

ゲイリー・トン

現在の住所: Lundbeck, Inc.、ディアフィールド、イリノイ州、60015

高橋宏人、Xia Peng、Cui Jiankun がこの作品に同様に貢献しました。

神経科学および老化研究センター、サンフォード・バーナム・プレビーズ・メディカル・ディスカバリー研究所、ラホーヤ、92307、カリフォルニア州、米国

高橋宏人、Peng Xia、Jiankun Cui、Maria Talantova、Karthik Bodinathan、Wenjun Li、Sofian Saleem、Emily A. Holland、Gary Tong、John Pineapple-Crespo、Dongxian Zhang、中西伸樹、Scott R. McKercher、中村知宏、Stuart Aリプトン

Panorama Research, Inc.、サニーベール、94089、カリフォルニア、米国

ジェームズ・W・ラリック

済南大学薬科大学新薬研究所、広州、510632、中国

王玉強

カリフォルニア大学サンディエゴ医学部神経科学科、ラホーヤ、92039、カリフォルニア、米国

スチュアート・A・リプトン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

SAL はすべての実験を設計および監督し、原稿を作成しました。 YW と JWL は、アミノアダマンタン硝酸塩の化学合成、構造活性相関の分析、ヒットとリードの最適化を実施しました。 HT、PX、MT、TT、JP-C.、KB、および DZ は電気生理学的実験を実行または分析しました。 JCとSSはWLTNの支援を受けて脳虚血の動物モデルの手術を実施し、EHSRMの支援を受けてNMDA受容体のS-ニトロシル化を示す薬力学的アッセイを実施し、NNはデータの分析、統計解析の実施、図の作成、および実験の支援を支援した。 SAL と SRM が原稿を執筆し、共著者全員が原稿の編集に参加しました。

著者らは、SAL が神経変性疾患に対するメマンチンおよびニトロメマンチンの使用に関する世界特許の発明者であると宣言します。 YW と JWL は、ニトロメマンチンの特許の発明者としても指名されています。ハーバード大学のガイドラインに従い、SAL は以前の所属機関であるボストン小児病院/ハーバード大学医学部とロイヤルティ共有契約に参加しており、同病院は医薬品メマンチン (Namenda®) を Forest Laboratories/Actavis にライセンス供与しました。さらに、SAL と JWL は、Forest/Actavis と共同でメマンチンの第 2 世代製剤を開発した Adamas Pharmaceuticals, Inc. の科学的創設者です。

この作品は、クリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材がクリエイティブコモンズライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

高橋宏、Xia、P.、Cui、J. 他脳血管疾患に対するニトロメマンチンによる薬理学的に標的化されたNMDA受容体拮抗作用。 Sci Rep 5、14781 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep14781

引用をダウンロード

受信日: 2015 年 3 月 11 日

受理日: 2015 年 9 月 9 日

公開日: 2015 年 10 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14781

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

ネイチャーケミカルバイオロジー (2023)

医療情報学およびバイオインフォマティクスにおけるネットワークモデリング分析 (2022)

最新の病態生物学レポート (2022)

分子精神医学 (2021)

分子神経生物学 (2021)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。