熱乳の統合メタボロミクス研究 - 成都極低温貯蔵有限公司

Scientific Reports volume 6、記事番号: 24208 (2016) この記事を引用

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8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

熱ストレス（HS）は、乳量と乳質の低下、健康への悪影響、乳牛の繁殖へのダメージなどにより世界の乳業にダメージを与え、毎年巨額の経済的損失を引き起こしています。しかし、HS 授乳中の乳牛の生理学的メカニズムの理解は依然としてとらえどころがありません。ここでは、LC-MS および 1H NMR 分光法を使用したメタボロミクス研究を実施して、HS を含まない乳牛と HS 乳牛の間の乳中のメタボロミクスの違いを分析し、診断用バイオマーカーと代謝経路の変化を発見しました。合計 53 の識別可能な代謝産物が、HS 非含有グループと比較して HS グループで有意に上方制御または下方制御されていました (P < 0.05)。これらのバイオマーカーは、炭水化物、アミノ酸、脂質、腸内微生物叢由来の代謝の経路に関与していました。これらの潜在的なバイオマーカーを血漿中の以前に同定されたHS候補バイオマーカーと比較すると、血漿中の乳酸、ピルビン酸、クレアチン、アセトン、β-ヒドロキシ酪酸、トリメチルアミン、オレイン酸、リノール酸、リゾホスファチジルコリン16:0、およびホスファチジルコリン42:2のレベル間に有意な相関関係が見られます。乳と血漿が検出され、血液と乳汁の関門が漏れやすくなり、乳中のこれら 10 種類のバイオマーカーのレベルが HS によって引き起こされる血液中のメタボローム変化を反映している可能性があることが示されました。これらの新たな発見は、HS 授乳中の乳牛の代謝経路における牛乳に基づく変化を解明するためのより詳細な研究を裏付ける可能性があります。

熱ストレス（HS）下にある授乳中の乳牛は、乳を生産して健康を維持するための体の要求を満たすことができないため、エネルギー摂取量が制限され、その結果、乳量と品質が低下し、乳牛が病気にかかりやすくなります1、2。その結果、中国 3、4、米国 5、ドイツ 6 など、多くの国の乳製品産業で多大な経済的損失が発生しています。 HS による代謝障害は、これらの損失の直接の原因です 1,7。これは、地球規模の気候変動による気温上昇を伴う、最新の分子遺伝学的技術を使用した牛乳の生産性向上の傾向を考えると、特に重要です8。

HS に対する反応はエネルギーバランスだけでなく、水、ナトリウム、カリウム、塩素の代謝にも影響を与えるため、牛がいつ HS に入るかを正確に判断することは困難です9。温湿度指数（THI）は依然として HS の最も一般的な指標ですが、THI 値 72 を HS 発症の閾値として使用しています10。これは気温と湿度に基づいてのみ判断でき、代謝の正確な尺度ではありません。 HS のもとでの乳牛の変化であり、牛特有の影響 (年齢と品種) およびその他の環境要因は考慮されていません。実際、HS によって引き起こされる乳牛の生理学的変化は多因子的です7。 HS 発症の閾値を診断し、その進行を監視し、その生理学的メカニズムについての洞察を提供するには、堅牢な代謝産物バイオマーカーが必要です。これにより、乳牛をケトーシスなどの病気から守るためのタイムリーな介入の実施が可能になります。

乳牛の能力に関するこれまでの研究は、HS による呼吸数、心拍数、乳量、体細胞数、タンパク質、脂肪、乳糖、基礎的な非エステル化脂肪酸 (FA)、インスリン、甲状腺の変化に焦点を当てていました。、牛乳中のノルアドレナリン、グルコース、血漿尿素窒素レベル7,11。しかし、代謝経路の全体的な変化に取り組んだ研究はほとんどなく、これらの変化の根底にあるメカニズムは不明のままです。

メタボロミクスは、植物、動物、人間の何十万もの低分子量代謝産物から情報を取得するための強力なプラットフォームであり、環境変化によって刺激される病態生理学的変化を包括的に理解するために使用できます12、13、14、15。。乳牛では、牛乳を非常に便利に収集でき、乳牛の授乳メカニズムの変化に関する情報を提供し、直接分析してその栄養品質を判断することができます。したがって、牛乳は生理学的変化を監視するための理想的な生体サンプルとみなされます。採血と比べ、牛乳の採取は非侵襲的で毎日行われるため、乳牛の代謝状態をリアルタイムに観察できます。その結果、牛を監視してHSの状態を判定し、HSの影響を軽減するための迅速な管理戦略を導入することができます。したがって、本研究では、LC-MS および 1H NMR 分光法を使用して、HS の有無にかかわらず授乳中期の牛の乳の代謝の違いを特定し、HS バイオマーカーを同定し、さまざまな HS 状態にある授乳中の乳牛の代謝経路の変化を調査しました。多重反応モニタリング (MRM) モードの LC-MS も、識別代謝産物の信頼性を検証するために使用されました。乳中の代謝物の乱れの原因を追跡するために、乳中に見つかった候補バイオマーカーと血液中の候補バイオマーカーとの部分ピアソン相関分析 16 が実行されました。サイトカイン、c 反応性タンパク質、シトクロム c の濃度を酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) を使用して検出し、HS 誘発炎症とアポトーシスについての洞察を得ました。全体として、この研究の結果は、HS に曝露された乳牛の代謝変化についての我々の理解を深めました。研究デザインの概要を図 1 に示します。

HS、熱ストレス。 MTBE、メチル tert-ブチルエーテル。 NMR、核磁気共鳴。 MVDA、多変量統計データ分析。 PCA、主成分分析。 PLS-DA、部分最小二乗判別分析。 OPLS-DA、直交部分最小二乗判別分析。

メタボロームデータの直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）プロットでは、HS フリー群と HS 群が重複することなく明確に分離されており（図 2A、B）、代謝プロファイルが有意に変化したことを示しています。 HSミルクのサンプルです。 HS フリーグループと HS グループの乳清と脂肪の 1H NMR データ (図 2A) と乳メタボロームの LC-MS データ (図 2B) から、満足のいくモデリングと予測を備えた 1 つの予測成分と 2 つの直交成分が特定されました。能力は 81.36% < R2 (Y) < 88.2%、および 63.9% < Q2 (cum) < 86.1% でした。モデルの過剰適合を回避するために、999 個のランダム順列テストによる 3 つのコンポーネントにわたる相互検証が実行され、すべてのデータに対して 0.015 < R2 < 0.239 および -0.275 < Q2 < -0.190 の切片が生成されました (図 2C、D)。モデルは有効でした16、17、18。

(A) 乳清と脂肪の 1H NMR データの OPLS-DA プロット。 (B) 乳メタボロームの LC-MS データの OPLS-DA プロット。 (C、D) 乳清と脂肪の 1H NMR データと乳メタボロームの LC-MS データの 999 回の置換テストを通じて取得された部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) モデルの検証プロット。

1H NMR データを分析することにより、表 1 に示す合計 25 の代謝候補を特定しました。これらの代謝産物は炭水化物、アミノ酸、脂質、腸内微生物叢由来の代謝産物であり、これらの代謝経路が HS で変化したことを示唆しています。グループ。図 3 は、乳脂肪から同定された代謝物の 1H NMR スペクトルの例を示しています。

(A) FA、脂肪酸。 (B) TC、総コレステロール。 (C) UFA、不飽和脂肪酸。 TAG、トリアシルグリセリド。 (D) PUFA、多価不飽和脂肪酸。

LC-MS データを分析すると、HS フリーグループと HS グループでは 119 個の代謝物が異なり、抽出されたイオンクロマトグラムと R パッケージの代謝物プロファイルアルゴリズムコレクションを使用して冗長変数を除去した後、これらの代謝物のうち 33 個が残っていることが明らかになりました。アノテーション（カメラ）16、19。これら 33 の代謝産物を検証するために、MRM モードの LC-MS を使用して確認検出を実行しました。最終的に、28 個の候補が検証され、特定されました (表 2)。尿素を除いて、他の 27 化合物は脂質代謝産物であり、HS グループでは脂質代謝が妨げられていることが示されました。

HS 群と HS を含まない群の間で異なる 1H NMR で同定された代謝産物を表 1 に示し、これらの潜在的な候補の変化に基づいてヒートマップを構築しました (図 4A)。炭水化物関連代謝産物におけるHS誘発性の変化は、乳酸、ピルビン酸、ガラクトース-1-リン酸、およびクエン酸で観察され、その濃度はHSを含まないグループと比較してHSグループでは1.27～1.79倍増加しました( P < 0.002)、フマル酸塩を除いて、HS 非含有グループと比較して HS では 0.78 倍減少しました (P < 0.001)。タンパク質やアミノ酸に関連する代謝産物であるイソロイシン、プロリン、オロチン酸、グリシン、ホスホクレアチンの濃度は、HS 非添加群と比較して HS 群では 0.69 ～ 0.88 倍変化した（P < 0.001）。クレアチンは、HS を含まないグループと比較して、HS グループでは 1.59 倍増加しました (P < 0.001)。脂質関連代謝産物である酪酸、アセトン、β-ヒドロキシ酪酸（BHBA）、FA、PUFA、および UFA の濃度は、HS を含まないグループと比較して、HS グループでは 1.08 ～ 1.38 倍増加しました（P < 0.02））。 N-アセチル糖 A、N-アセチル糖 B、N-アセチル糖 C、N-アセチル糖 D、および TC の濃度は、HS を含まないグループと比較して、HS グループでは 0.68 ～ 0.91 倍変化しました (P < 0.01) ）。腸内マイクロバイオーム由来の代謝のHS誘発性の混乱も確認され、トリメチルアミン（TMA）の濃度はHS非含有群と比較してHS群で0.52倍変化した（P < 0.001）。

HS および HS を含まないサンプルからの (A) 1H NMR データおよび (B) LC-MS データの教師なし階層クラスタリングのヒートマップ表示。赤と緑の色合いは、HS フリーグループの代謝物濃度と比較した代謝物濃度の増加と減少をそれぞれ表します。行: 代謝物。列: サンプル。

HSによって変化したLC-MS同定された代謝産物を表2に示し、HSフリーグループとHSグループ間のこれらの潜在的な候補の変化に基づいてヒートマップを構築しました（図4B）。これらの代謝産物のほとんどは脂質であり、オレイン酸、リノール酸、およびリゾホスファチジルコリン (lysoPC) 16:0 の濃度は、HS を含まないグループと比較して HS グループで 1.28 ～ 1.41 倍変化しました (P < 0.005)。また、ホスファチジルコリン（PC）、スフィンゴミエリン（SM）、モノアシルグリセロール（MG）、ジアシルグリセロール（DG）、トリラジルグリセロール（TG）は、HS非含有群と比較してHS群では0.48～0.83倍変化した（P < 0.02）。アミノ酸に関連する尿素の濃度は、HS を含まないグループと比較して、HS グループでは 1.32 倍増加しました (P < 0.01)。

表 3 は、治療グループ (HS および HS フリー) の補正を加えた、血漿および乳中の候補代謝産物の相関係数を示しています。血漿および乳中の乳酸、ピルビン酸、クレアチン、アセトン、BHBA、および TMA レベルの間には、有意な相関関係が観察されました (P < 0.001)。オレイン酸、リノール酸、lysoPC 16:0、および PC 42:2 の相関の有意性は 0.01 未満でした。さらに、乳酸とピルビン酸のレベルと、乳と血漿中のアセトンとBHBAのレベルの間にも有意な相関関係が検出されました（P < 0.01）。

補足表S6には、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、c反応性タンパク質、p53、Bax、Bcl-2、シトクロムc、カスパーゼ-3、カスパーゼの濃度の変化がリストされています。 HS および HS を含まないグループの血漿および乳汁には、-8、およびカスパーゼ-9 が含まれています。これらすべてのタンパク質のレベルは、HS 群の方が HS を含まない群よりも有意に高かった (P < 0.05)。ただし、Bcl-2 と IL-12 は HS 群の方が HS 群よりも有意に低かった。フリーグループ (P < 0.05)。

補足表S7〜S8には、直腸温度と血漿および乳汁中の候補代謝物レベルとの間の相関係数がそれぞれリストされています。血漿中の乳酸、ピルビン酸、クレアチン、プロリン、リジン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、オルニチン、シトルリン、アルギニンの濃度と直腸温との間には、乳酸塩と直腸温との間に有意な相関関係が観察されました（P < 0.01）。牛乳中のピルビン酸、クレアチン、およびクエン酸のレベルと直腸温 (P < 0.01)。補足表 S9 は、血漿および乳中のサイトカインおよび候補代謝産物レベルの相関係数を示しています。血漿および乳汁の両方において、p53、Bax、Bcl-2、およびシトクロム c とアセトンおよび BHBA の間に有意な相関関係が認められました (P < 0.01)。補足表 S10 は、血漿および乳中のシトクロム c と c 反応性タンパク質レベルの間の有意な相関関係を示しています (P < 0.01)。

本研究では、授乳期の乳牛のHS状態の診断に使用できる可能性のある53の代謝産物バイオマーカーが同定された。これらの潜在的なバイオマーカーは、炭水化物、アミノ酸、脂質、および腸内微生物叢由来の代謝の経路に関与しており、これらの代謝経路がHSの影響を受けることを示しています。

HS 乳牛からの血漿に関する以前のメタボロミクス研究で観察されたように、HS は、今回のメタボロミクス研究において HS 乳牛からの乳中のピルビン酸および乳酸レベルを上方制御しました16。 HS および HS を含まない牛の血漿および乳中のピルビン酸または乳酸レベルの相関分析 (表 3) により、血漿ピルビン酸および乳酸濃度が乳中のそれぞれの濃度と有意に相関していることが明らかになり、これら 2 つの代謝産物が乳牛から直接分泌されることが示されました。血液は乳腺を介して乳に流れ込みます20。

牛乳のクエン酸濃度は、HS を含まないグループと比較して、HS グループで増加しました。この種は乳牛のエネルギーバランスのバイオマーカーとして使用されており、牛乳中のケトン体の存在および新規FA合成と相関しています21。乳房上皮は両方向のクエン酸塩に対して不透過性であるため、乳汁のクエン酸塩レベルは、一般的な代謝の障害ではなく、HS によって誘発される乳房機能の障害を反映しています。私たちの以前の研究で指摘されたHS群とHSを含まない群の間の血漿クエン酸値のわずかな差は16、牛乳のクエン酸値が血中のクエン酸代謝の変化ではなく、HSによって誘発される乳房機能の障害を反映しているという仮説をさらに裏付けるものである。 HS ミルクサンプル中のフマル酸塩濃度の低下は、エネルギー代謝の乱れとトリカルボン酸回路の機能障害によって引き起こされた可能性があります 22。

乳糖は、ほとんどの種のミルクに含まれる主な糖です。乳生産におけるグルコース代謝の役割は、乳糖合成のために血液から乳腺にグルコースを輸送することであり、乳の浸透圧調節に関連する乳量において重要な機能を持っています 23,24。本研究では、HS 群と HS 無添加群の乳乳糖濃度に有意差は確認されませんでしたが、HS 群の乳量は HS 無添加群と比較して大幅に減少しました (補足表 S4) (P < 0.01)。。その結果、乳糖収量が減少し、乳腺に利用できる血糖が減少したか、乳糖合成が中断されたことが示唆されました。

乳中のガラクトース-1-リン酸濃度の増加は、おそらく細胞アポトーシスを介して、乳房上皮細胞から乳中へのこの成分の漏出に起因すると考えられ、エネルギーバランス状態に強く依存しているようです25。ネガティブエネルギーバランス（NEB）は、乳腺のアポトーシス指数を大幅に上昇させる可能性があります25。 HS 乳牛は NEB 状態にあり、これが今回の研究で牛乳中のガラクトース-1-リン酸レベルの増加を引き起こした可能性があります。 HS グループにおける N-アセチル糖 A、N-アセチル糖 B、N-アセチル糖 C、および N-アセチル糖 D レベルの減少は、HS がそれらの前駆体のレベルを低下させるか、または関連する酵素に影響を与えることによって、それらの合成を変化させたことを示しています。

HS を含まないグループと比較して、HS グループの乳サンプルではイソロイシン、プロリン、オロチン酸、グリシン、およびホスホクレアチンの濃度の低下が検出されました。しかし、これらの代謝産物の濃度は、我々の以前のメタボロミクス研究では HS 乳牛の血漿中で上方制御されていました 16。これらのアミノ酸は、糖新生によるグルコース生成や脱アミノ化と酸化によるエネルギー生成の主な前駆体である可能性があり 26、乳腺を介した乳への分布を減少させる可能性があります。細胞内では、アミノ酸は代謝反応に関与し、特に CO2、尿素、ポリアミン、非必須アミノ酸 (NEAA) を生成します。 HS 乳牛の血漿サンプル中の尿素濃度の上昇は、乳腺細胞内でより多くのアミノ酸が乳タンパク質よりも尿素に代謝されたことを示しています。直腸温度は、血漿中のプロリン、リジン、クレアチニン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、オルニチン、シトルリン、アルギニン、およびクレアチンレベルと有意に相関しており（補足表S7）、HSが骨格筋タンパク質のアミノへの異化作用を増加させたことを示唆しています。血漿中の酸27．直腸温度と、血漿および乳汁の両方における乳酸塩およびピルビン酸塩レベルとの間に有意な相関関係が観察され(補足表S8)、嫌気性解糖の亢進を示しています。

授乳中の牛では、NEB は体のエネルギー貯蔵の動員と関連しており、脂肪組織の脂肪分解の拡大と非エステル化 FA の血流への分配につながります 25。この分配は、不飽和 FA (UFA) 濃度、主に C18:1 (オレイン酸) および C18:2 (リノール酸) の増加などにより、乳清中の FA プロファイルに影響を与えます。同じ傾向が乳脂肪組成の結果でも観察され、HS グループの牛の乳中の UFA および多価不飽和 FA (PUFA) の濃度が高いことが示されました。牛では、UFA の存在は乳房炎や子宮炎などの炎症性疾患に関連しています。コレステロールは、リポタンパク質粒子を介して体全体に輸送されます。 HS 投与中の授乳中の乳牛の血漿に関する以前の研究では、HS が高密度リポタンパク質 (HDL) および超低密度リポタンパク質/低密度リポタンパク質 (VLDL/LDL) の濃度を低下させ、乳房へのそれらの供給を減少させることが示されました。細胞16．乳脂肪中のコレステロール濃度は、HS を含まないグループよりも HS グループの方が低く、HS ではコレステロールの合成と乳中への輸送が制限されていることを示しています。

BHBA とアセトンの濃度は、HS を含まないグループと比較して、HS グループで有意に増加しました。これらの変化は、HS 乳牛を対象とした以前の血漿メタボロミクス研究と一致しました 16。偏相関分析により、HS および HS を含まない状態の授乳中の乳牛の乳中の BHBA およびアセトン濃度が、以前の研究で報告された血漿中濃度と有意に相関していることが明らかになりました (P < 0.01)16。血液中のアセトンは、変化せずに乳腺細胞を介して乳中に移行します。したがって、牛乳中の BHBA およびアセトン濃度の上昇は、血中 BHBA およびアセトンレベルの上昇を示している可能性があります。これらは乳牛のエネルギー状態のよく知られたマーカーであり、過剰なタンパク質動員と不十分なグルコース供給を反映しています 21。

HS 群の血漿と乳汁の両方で、アポトーシス関連分子である P53 タンパク質、Bax、シトクロム c、カスパーゼ-3、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9 の増加、および Bcl-2 の減少が検出されました 28。 P53 タンパク質の増加は、アポトーシスのためのルーティングタンパク質の生合成を促進する可能性があります。 Bcl-2 と Bax 比のバランスは、アポトーシスシグナルに対するミトコンドリア反応の重要な調節因子として機能し、その不均衡はチトクロム c の放出を引き起こし、細胞のアポトーシスを予測する可能性があります。カスパーゼ-8 のせん断活性化により、カスパーゼカスケード反応が開始されます。カスパーゼ-3 とカスパーゼ-9 は、それぞれアポトーシスの実行者と開始者とみなされます。 BHBA とアセトンの濃度は、血漿と乳汁の両方における P53 タンパク質、Bax、Bcl-2、およびチトクロム c と有意に相関しており (補足表 S9)、NEB がアポトーシスを増加させることを示唆しています 29。

PC 40:1、PC 40:0、PC 42:2、PC 44:3、および PC 44:1 を含む PC の濃度は、HS を含まないグループよりも HS グループの方が低かったのに対し、 lysoPC 16:0 は、HS 非含有グループよりも HS グループの方が高かった。 LysoPC は、ホスホリパーゼ A1、A2、および D30、31 によって制御される PC 異化の代謝産物です。 PC および lysoPC 濃度で観察された変化は、HS 乳牛を対象とした以前の血漿メタボロミクス研究と一致していました 16。 SM、MG、DG、TGなどの牛乳中の他の脂質関連代謝物も、HSグループでは下方制御されていました。総合すると、これらの発見は、HS が授乳中の乳牛の血液と乳の両方における脂質代謝の全体的な変化を誘発することを明確に示しています。

乳汁と血漿中の TMA レベルの間には強い相関関係があり、血漿 TMA レベルの変化 16 が乳中の TMA 濃度に影響を与えることを示しています (表 3)。我々は、HS が HS を含まない牛と比較して、HS 牛の乳 TMA レベルの顕著な低下を引き起こすことを発見しました (表 1)。このことから、HS が腸内微生物の数や活動の変化を引き起こしたと考えられます。

牛の免疫機能は HS32 によって影響を受ける可能性があります。 HS 群の血漿と乳汁の両方における c 反応性タンパク質、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-15 の増加、および IL-12 の減少は、HS 誘発炎症に対する反応とみなされます 29,33,34 、HSグループの免疫系の障害が確認されました。シトクロム c および c 反応性タンパク質の血漿レベルは、牛乳中のそれぞれの濃度と有意に相関しており (補足表 S10)、HS が乳牛の全身の炎症反応を誘発したことを示唆しています 33。乳房の免疫反応中に、血液と乳汁の関門が損なわれます 35。したがって、以前に報告された血漿中の乳酸、ピルビン酸、クレアチン、アセトン、BHBA、TMA、オレイン酸、リノール酸、lysoPC 16:0、および PC 42:2 レベルのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション 16 は、牛乳でも観察されました。本研究では（表 3）。乳中のこれら 10 個の候補バイオマーカーのレベルは、それぞれの血中濃度と有意に相関していましたが、乳中の残りの 43 個の潜在的なバイオマーカー (表 1 および 2) は同様の相関を示さず、前者の 10 個のバイオマーカーが HS 誘発性の影響を反映している可能性があることを示しています。残りの 43 は、一般的な代謝障害ではなく、乳房機能の障害を反映しています。

乳酸中の候補バイオマーカーである乳酸、ピルビン酸、クレアチン、アセトン、BHBA、TMA、オレイン酸、リノール酸、lysoPC 16:0、および PC 42:2 のレベルは、血中の HS のそれぞれの濃度と強い相関関係を示したためです。遊離乳牛および HS 乳牛では、これらの乳代謝産物の検出により、HS の状態および一般的な代謝における HS によって誘発される混乱を診断できます。他の潜在的なバイオマーカーは、HS 乳牛の乳腺機能における HS 誘発性の変化を反映している可能性があります。この結果は、授乳中の乳牛のHS状態を正確に監視するために使用できる潜在的なバイオマーカーを特定しており、HSによって誘発される代謝経路の変化の根底にある生理学的メカニズムを解明するためにさらなる研究が必要である。これは、HS に曝露された乳牛の管理慣行の改善につながる可能性があります。

動物を含むすべての実験は、研究プロトコールを承認した中国農業科学院動物管理使用委員会（中国、北京）の原則に従って実施されました。

酸化重水素および重水素化クロロホルムは、USA Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (米国マサチューセッツ州テュークスベリー) から購入しました。３－（トリメチルシリル）プロピオン－２，２，３，３，ｄ４プロピオン酸ナトリウム塩は、ＭｅｒｃｋＣａｎａｄａＩｎｃ．（カナダ、ＱＣ、カークランド）から購入した。 HPLC グレードのメタノール、メチル tert-ブチルエーテル、水、ギ酸、およびギ酸アンモニウムは、Merck (ダルムシュタット、ドイツ) から購入しました。

NRC (1971) によると、THI は次の式を使用して計算されました: THI = (1.8 × Tdb + 32) −[(0.55−0.0055 × RH) × (1.8 × Tdb −26.8)]、ここで Tdb は乾球温度です(°C)、RH は相対湿度 (%) です。この試験では、同じ飼料を与えられた、授乳中期の第 2 出産のホルスタイン種牛 44 頭が使用されました。 HS を含まないグループは 22 頭の牛で構成され、春の季節に 50 ～ 55 の THI の下で 1 か月間乳サンプルを採取しました。 HS グループは 22 頭の牛で構成され、THI が 1 か月かけて 68 から 80 まで徐々に増加し、1 週間は 80 で安定した後、夏期にサンプルを採取しました。朝の牛乳サンプルは授乳前に収集され、さらに使用するまで -80 °C で保存されました。選択した乳牛の詳細な特性、飼料組成、温度、湿度、直腸温度、呼吸数、および乳牛の 2 つのグループの生産特性を、報告された論文を参照して補足表 S1 ～ S4 に示します。

牛乳サンプルを室温で解凍し、均質化し、20000 g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。すべてのサンプルは、z 軸勾配コイルを備えた 5 mm 逆プロトン (HX) 三重共鳴プローブを使用して 599.871 MHz で動作する VARIAN VNMRS 600 MHz NMR SPECTROMETER (Varian Inc.、カリフォルニア州パロアルト) を使用して 298 K で分析されました。。乳清の 1H NMR スペクトルは、水を抑制した標準 1D CPMG パルスシーケンス (RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ) を使用して記録しました。ゆっくりと回転する分子 (タンパク質など) からの幅広い NMR シグナルを減衰させ、低分子量化合物や一部の脂質成分からのシグナルを保持するために 320 ms が適用されました 36。自由誘導減衰 (FID) は、スペクトル幅 12000 Hz および 128 スキャンの 64 K データポイントを介して収集されました。 FID は 2 倍のサイズにゼロで埋められ、フーリエ変換 (FT) の前に 0.5 Hz の指数関数的な線幅拡大係数が乗算されました。乳脂肪の 1H NMR スペクトルでは、水の共鳴を事前に飽和させる必要はありません。ここでは、完全に緩和されたスペクトルを測定しているため、単純な 901 パルス取得シーケンスを使用しました。 64 個の過渡現象を 32,768 個のデータポイントに収集しました。他のパラメータは次のとおりです:緩和遅延 = 2 秒、スペクトル幅 = 20 ppm、取得時間 = 1.36 秒。代謝産物は、実験スペクトルを Chenomx スペクトルデータベース (エドモントン、AB、カナダ) に挿入し、標準化合物のスペクトルと比較することによって同定されました。

50 マイクロリットル (50 μL) の牛乳を、メタノールとメチル tert-ブチルエーテル (MTBE) からなる溶媒 350 μL と 1:1 (v:v) の比率で混合し、内部標準としてビタミン E 酢酸塩を添加しました ( ＩＳ）、最終濃度２５ｐｐｍ。溶液を Captiva 96 ウェルフィルタープレート (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を通して濾過しました。 LC-MS/MS 分析は、島津超高速 LC (UFLC) 20ADXR システムおよび 5600 Triple TOF 質量分析計 (Applied Biosystems/MDS Sciex、Concord、ON、Canada) を使用して実行されました。調製したサンプル 5 マイクロリットル (5 μL) を 40 °C でカラムに注入しました (ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm、2.1 × 100 mm カラム、Waters、ダブリン、アイルランド)。オートサンプラーの温度は 15 °C に維持されました。グラジエントは、移動相 A (水中の 10 mM ギ酸アンモニウム) と移動相 B (メタノール中の 10 mM ギ酸アンモニウム) で構成され、合計実行時間 33 分以内に 0.3 mL/min でポンプ送られました。直線勾配は、1 分で 70% B、15 分で 99% B、20 分で 99% B、20.1 分で 1% B、および 33 分で 1% B でした。エレクトロスプレーイオン化 (ESI) 源を陽イオン化モードに設定しました。検出用の MS パラメーターは次のとおりです。ESI 電源電圧 5.5 kV。気化器温度、550 °C; 乾燥ガス (N2) 圧力、60 psi。ネブライザーガス (N2) 圧力、60 psi。カーテンガス (N2) 圧力、30 psi。スキャン範囲は m/z 60 ～ 1,000 でした。データの取得と処理は、Analyst® TF 1.6 ソフトウェア (Applied Biosystems/MDS Sciex) を使用して実行されました。自動キャリブレーションは、陽イオンモードと陰イオンモードの両方で Calibrant Delivery System を使用して実行されました。代謝産物は、MS/MS 分析の情報依存取得モードを使用して同定されました。衝突エネルギーは３５ｅＶであった。イオン構造を特定するために、高分解能 MS、同位体存在比、MS/MS、ヒトメタボロームデータベース、METLIN データベース 37、文献検索、および標準との比較が使用されました。品質管理 (QC) サンプルは、10 回の LC-MS 実行ごとに検出され、機器の再現性を監視しました。分析中、異なるグループからの血漿サンプルをランダムに交互に使用しました。自動キャリブレーションは、陽イオンモードと陰イオンモードの両方で Calibrant Delivery System を使用して実行されました。

生の 1H NMR スペクトルは、TopSpin ソフトウェア (バージョン 3.0; BrukerBiospin) を使用して位相とベースラインの歪みを手動で補正し、乳清スペクトルおよび 3-(トリメチルシリル) プロピオン酸のラクトースのアノマー二重項共鳴 (δ 5.233 ppm) を参照しました。乳脂肪スペクトルの -2,2,3,3,d4 酸ナトリウム塩 (δ 0.0 ppm) シグナル。 AMIX ソフトウェアパッケージ (バージョン 3.8.3、BrukerBiospin) を使用して、すべての試料の 1H NMR スペクトルを 0.001 ppm の積分領域にビン化し、水 (δ 4.7 ～ 5.12) を除いて 0.5 ～ 7.0 ppm の領域にわたって積分しました。サンプル濃度の差を補償するために、スペクトルはスペクトル積分の総和に正規化されました。乳清および脂肪データからの 2 次元データ行列は、その後の SIMCA-P 分析のために 1 つの Excel ファイルに統合されました。

生の LC-MS データファイル (.wiff) は、ProteoWizard (http://metlin.scripps.edu/xcms/download/pwiz/pwiz.zip) を使用して mzXML 形式に変換されました。ファイルは、ピーク識別、フィルタリング、およびアライメントのために R 統計ソフトウェア (バージョン 2.10.0) のオープンソース XCMS パッケージ (バージョン 1.20.1) を使用して処理されました 38。 XCMS の実装中、R パッケージ CAMERA を使用して、同位体、付加物、およびプロダクトイオンのピークに注釈が付けられました。結果として得られる 2 次元行列 (列内の観測値 (サンプル名)、行内の変数 (m/z 保持時間のペア)、およびピーク面積を含む) は、CSV ファイルとして保存されました。 IS はデータの品質管理 (再現性) と正規化に使用されました。

結果として得られたデータセットは、SIMCA-P 13.0 ソフトウェアパッケージ (Umetrics AB、スウェーデン、ウメオ) にインポートされました。モデル内のノイズとアーチファクトを低減するために、パレートスケーリングとセンタースケーリングがそれぞれ LC-MS と 1H NMR データに適用されました。スケーリングされたデータに対して主成分分析 (PCA) が実行され、全体的なクラスタリングと分離の傾向または外れ値が視覚化されました。 PLS-DA モデルを適用して、999 回のランダム順列テストによる過学習に対するモデルの検証を行いました。識別変数は、S プロット、投影値の変数重要度 (VIP >1)、および OPLS-DA モデルの生データプロットに従って選択されました 16、17、18。さらに、独立した t 検定 (P < 0.05) (SPSS バージョン 13.0) を使用して、HS グループと HS のないグループを区別する際の各代謝産物の重要性を決定しました。

牛乳中で発見されたすべての潜在的なバイオマーカーのレベルと、同時に収集された検体から以前に報告された血漿中のそれぞれの濃度との間の相関を分析するために、部分ピアソン相関係数を 2 つの信頼水準 (0.01 および 0.001) で計算しました。 http://mendes.vbi.vt.edu/tiki-index.php?page からダウンロードできる ParCorA ソフトウェアプログラムを使用して、HS グループを最初の順序でグループ化します。 Cluster 3.0 と Treeview は、それぞれクラスター分析と視覚化に別々に使用されました。

クロマトグラフィーの勾配溶出条件は変更しませんでした。溶離液を、ESI源(QTRAP 5500、Applied Biosystems/MDS Sciex)を備えたトリプル四重極トラップ質量分析計に注入した。 LC-MS によって発見された潜在的な候補はすべて、MRM モードの UFLC-MS/MS によって検出されました。対象の分析物ごとに、衝突エネルギーとプリカーサー/フラグメントイオンのペアが事前に最適化され、最適な信号対雑音比が生成されます。 MRM 移行は補足表 S1 にリストされています。

血漿と乳汁の両方におけるサイトカイン、c 反応性タンパク質、およびシトクロム c 濃度は、市販のウシ特異的 ELISA キット (Abcam®、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国) を製造者の指示に従って使用して分析しました。

この記事を引用する方法: Tian, H. et al. 熱ストレスを受けた授乳中の乳牛の乳の統合メタボロミクス研究。科学。議員6、24208; 土井: 10.1038/srep24208 (2016)。

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この研究は、中国国家重点基礎研究プログラム（中国、北京; 2011CB100805）、農業科学技術イノベーションプログラム（ASTIP-IAS12）、中華人民共和国研究システム（nycytx-04-01）によって支援されました。、および中国ポスドク科学財団の資金提供プロジェクト（中国、北京; 2014M550907）による。

He Tian、Nan Zheng、Weiyu Wang: これらの著者はこの作品に同様に貢献しました。

中国農業科学院動物科学研究所、北京、100193、中国

He Tian、Nan Zheng、Songli Li、Yangdong Zhang、Jiaqi Wang

中国人民大学付属高等学校、北京、100080、中国

ワン・ウェイユ

安徽農業大学動物科学技術学部、合肥、230036、中国

チェン・ジャンボ

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JW は研究全体を計画し、監督しました。 JW、HT、NZ、WW が実験を計画しました。 JC、SL、YZ は乳牛を選び、牛乳サンプルを収集して提供しました。 HT は NMR および LC-MS 分析、データマイニングを実行し、原稿を執筆しました。 JWは原稿を修正しました。 JW、HT、NZ、WW は結果の意味を明らかにしました。

Jiaqi Wang への通信。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Tian, H.、Zheng, N.、Wang, W. 他熱ストレスを受けた授乳中の乳牛の乳の統合メタボロミクス研究。 Sci Rep 6、24208 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep24208

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受信日: 2016 年 1 月 13 日

受理日: 2016 年 3 月 22 日

公開日: 2016 年 4 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24208

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