インドールエチルアミンN

Scientific Reports volume 13、記事番号: 280 (2023) この記事を引用

1673 アクセス

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

インドールエチルアミン N-メチルトランスフェラーゼ (INMT) は、メチル供与体である S-アデノシル-L-メチオニンを利用して、メチル基を小分子受容体化合物のアミノ基に転移するメチル基転移酵素です。 INMT は、哺乳類の脳やその他の組織に見られるサイケデリックな化合物である N,N-ジメチルトリプタミン (DMT) の生合成における役割で最もよく知られています。 哺乳類では、DMT の生合成はトリプタミンの二重メチル化を介して起こると考えられており、INMT は最初に N-メチルトリプタミン (NMT) の生合成を触媒し、次に DMT の生合成を触媒します。 ただし、INMT が内在性 DMT の生合成に必要かどうかは不明です。 これをテストするために、我々は新しい INMT ノックアウト ラット モデルを作成し、放射性酵素アッセイ、薄層クロマトグラフィー、および超高速液体クロマトグラフィー タンデム質量分析を使用してトリプタミンのメチル化を研究しました。 また、組換えラット、ウサギ、およびヒト INMT におけるトリプタミンのメチル化についても研究しました。 我々は、野生型ラットとINMTノックアウトラットの両方の脳組織と肺組織が同じレベルのトリプタミン依存性活性を示すが、酵素生成物はNMTでもDMTでもないことを報告する。 さらに、ラットの INMT は NMT または DMT の生合成には十分ではありませんでした。 これらの結果は、ラットにおける DMT 生合成の代替酵素経路を示唆しています。 この研究は、哺乳類における内因性 DMT 生合成の新規経路の研究を動機づけています。

インドールエチルアミン N-メチルトランスフェラーゼ (INMT) は、補因子 S-アデノシル-L-メチオニン (SAM) から小分子アクセプター基質のアミノ基へのメチル基の転移を触媒するメチル基転移酵素です1。 この酵素は、いくつかの内因性アミンおよび他の小分子に対して広範な基質特異性を有しており、通常、トリプタミンおよび N-メチルトリプタミン (NMT) が酵素の主要基質とみなされます 2,3。 SAMをメチル供与体として利用する2段階反応において、INMTはトリプタミンのアミノ側鎖へのメチル基の転移を触媒し、最初にNMTを形成し、次にN,N-ジメチルトリプタミン（DMT）を形成します（図1）。 この経路は、1961 年に Axelrod4 によって最初に記載されました。彼は、ラジオメトリック酵素アッセイと薄層クロマトグラフィーを使用して、トリプタミンおよび C14-SAM とインキュベートしたウサギ肺抽出物が C14-NMT および C14-DMT を生成することを実証しました。 この研究は、「精神模倣性」代謝産物が天然に存在する化合物から酵素的に形成できることを示した最初の研究の1つです。

哺乳類の DMT 生合成経路。 トリプタミンのメチル化による N,N-ジメチルトリプタミンの生成は、酵素インドールエチルアミン-N-メチルトランスフェラーゼ (INMT) によって触媒され、N-メチルトリプタミン (NMT) が中間体として起こる 2 段階の反応によって起こると考えられています。 補因子 S-アデノシル-L-メチオニン (SAM) はメチル供与体として機能し、S-アデノシル-L-ホモシステイン (SAH) はこのメチル転移の副産物として機能します。

INMT mRNA 発現は複数の哺乳類種で調査されており、ウサギの脳、肝臓、肺 1、心臓、肺、肝臓、副腎を含むいくつかのヒト組織 5、さらには脳、肝臓、肺、腎臓、心臓でも報告されています。 、ラットの副腎6。 さらに、アカゲザルの松果体、脊髄、網膜の組織でも INMT タンパク質の発現が実証されています7。 肺組織、特にウサギからの抽出物は、歴史的に他の組織と比較して、INMT の発現が高く、トリプタミンおよび NMT に対するメチル化活性が高いことが示されています 1、8、9。 その結果、ウサギの INMT がクローン化され特徴付けられた最初の INMT となり、すぐにヒトの INMT がそれに続きました 1,5。 COS-1 細胞で発現させた場合、両方の組換えタンパク質は、それぞれ (平均 ± SEM) 0.27 ± 0.05 および 2.92 ± 0.07 の見かけの Km (mM) 値で、トリプタミンのメチル化が十分であることが示されました 1,5。

INMT の内因性の役割は完全には理解されていませんが、この酵素はおそらく、内因性トリプタミンをメチル化して二重メチル化サイケデリック化合物 DMT10 を形成する機能で最もよく知られています。 DMT は神経伝達物質セロトニン (5-HT) と構造的に類似しており、人間に投与するとサイケデリックな効果を生み出し 11、さまざまな植物種や哺乳類の組織や体液でも内因的に発生します 12。 内因性 DMT の存在は、1965 年に血液と尿の分析によってヒトで初めて確認され 13、その後、ガスクロマトグラフィー (GC) や高性能分析などのさまざまな高度な分析技術によって、ヒトの血液、尿、脳脊髄液でも確認されてきました。液体クロマトグラフィー (HPLC) と質量分析 (MS) を組み合わせたもの (詳細なレビューについては参考文献 14 を参照)。 しかし、脳内の DMT の in vivo サンプリングはげっ歯類の研究に限定されており、ラットがこの目的で最も広く研究されている種です。 いくつかの報告により、ラットの脳およびその他の組織における内因性 DMT の存在が確認されています。 Saavedra と Axelrod は、ラットに C14-トリプタミンの大槽内注射を実施し、複数の溶媒系を用いた薄層クロマトグラフィーによって C14-NMT および C14-DMT の全脳回復を実証しました 15。 Beaton と Morris は、GC-MS16 を使用して、さまざまな発達段階にある未治療のラットの全脳抽出物から DMT を検出し、定量しました。 ケルカイネンら。 モノアミンオキシダーゼ阻害剤 (MAOI) でラットを前処理し、HPLC タンデム質量分析 (MS/MS) を使用して腎臓、肺、肝臓、脳の組織に DMT が存在することを発見しました17。 バーカーら。 たちは、自由に行動する未治療のラットの後頭皮質で微量透析によって収集された灌流液サンプルを分析し、LC-MS/MS18を使用してDMTの存在を確認しました。 最後に、ディーンら。 らは、蛍光検出を備えた HPLC を使用して、自由に行動する未治療のラットの後頭皮質から採取した灌流液サンプル中の DMT を定量し、内因性 DMT レベルが 0.05 ～ 2.2 nM6 の範囲であることを示しました。

INMT 生化学には、トリプタミンのメチル化におけるその機能と役割の明確な理解を妨げる特定の側面があります。 これは、INMT 機能を調べる初期の研究の多くが、粗製または部分的に精製されたタンパク質抽出物を利用した ex vivo アッセイに依存していたという事実に一部起因しています。 これらの技術は、組織の広範な酵素活性を理解するのに役立ちますが、単一の酵素の活性を特徴付けるには不十分です。 この限界を示す 1 つの指標は、タンパク質抽出物からの酵素活性の不規則性が報告されていることです。 実際、さまざまな組織源からの抽出物を利用した複数の研究では、これらの組織からの酵素が内因性化合物や生体異物を含む最大 34 種類の異なる基質と相互作用することが報告されています 2,3,19。 これらの発見は、多くの場合、「INMT 活動」に起因するものとして大まかに特徴づけられましたが、その特徴づけには方法論が不十分でした。 これらの技術の限界を示すもう 1 つの指標は、アッセイ条件が変化する場合、または同じ種内の異なる組織に由来する場合、タンパク質抽出物が基質に対する活性および親和性のレベルが一貫していないように見えることです。 たとえば、アクセルロッドはウサギの肺の粗抽出物からの酵素を使用して、5-HT が好ましい基質であることを特定し、トリプタミンと NMT はそれぞれ 5-HT の活性の 81% と 39% を示しました 3。 しかし、同じ供給源からの酵素を使用した他の研究では、Km 値が 50 μM の NMT が好ましい基質であり、続いて Km 値が 330 μM のトリプタミンであることがわかりました8,9,20。 ニワトリの粗脳抽出物からアッセイされた酵素活性は、5-HT が好ましい基質であることを示し、トリプタミンと NMT はそれぞれ 60% と 47% の相対活性を示しました 21。また、ヒトの脳抽出物を用いた研究では、トリプタミンが好ましい基質であることが示されました (111% )、5-HT (100%) および NMT (55%) と比較。 最後に、粗ラット脳抽出物からの酵素活性はさらなる不一致を示し、トリプタミンが好ましい基質 (Km = 27.8 μM)、次に NMT (Km = 36.8 μM) でした 22。

対象となる特定の酵素の活性を研究するためのより直接的なアプローチは、精製された組換えタンパク質の利用です。 Thompson らはこのアプローチを最初に採用し、ウサギとヒトの INMT の両方をクローニング、発現、特性評価し、これらの酵素の両方が実際にトリプタミンをメチル化することを確認しました 1,5。 しかし、ラットが脳内内因性DMT検出のモデル種として機能してきたという事実にもかかわらず、これまでのところ、組換えラットINMTの活性を特徴づけたり、現代のトランスジェニックアプローチを用いてラットINMTを調査したりする研究は存在しない。

内因性 DMT の生合成において INMT が果たす役割をより深く理解するために、我々は CRISPR/Cas9 を利用して新しい INMT 欠損ラット モデルを開発しました。 ラットが選ばれたのは、これまでラットがインビボでの DMT 検出のモデル種であったためです。 INMT の主な機能は、NMT と DMT を形成するトリプタミンのメチル化であると長い間考えられてきたため、我々は、INMT 欠損ラットの組織にはこれらの機能が欠如しているのではないかと仮説を立てました。 この仮説を検証するために、我々は INMT+/- 交雑からの同腹子ペアを使用して、INMT +/+ (WT) と INMT -/- (KO) ラットの間の脳および肺組織におけるトリプタミンメチル化活性を比較しました。 この研究以前には、組換え INMT の研究はウサギおよびヒト INMT のみに限定されていたため、大腸菌で発現させた組換えラット、ウサギ、およびヒト INMT のトリプタミンメチル化活性も比較しました。 酵素アッセイの反応生成物の同定と定量を含む酵素活性を研究するために、シンチレーションカウンティングを備えた放射分析酵素アッセイ、蛍光イメージングを備えた薄層クロマトグラフィー、超高性能液体などの一連の実験技術と分析ツールを使用しました。クロマトグラフィー タンデム質量分析 (uHPLC-MS/MS)。

CRISPR/Cas9 を使用して、ラット INMT 遺伝子のエクソン 1 に 2 ヌクレオチドの欠失が導入され (図 2a)、フレームシフト変異が生じ (図 2b)、ラットでは INMT タンパク質発現が消失しました (図 2c)。 。 ラットにおける INMT 発現の有無は、尾の切片からの PCR 産物および肺組織ホモジネートを使用したウェスタンブロットによって確認されました。 INMT の欠失は明らかな行動的または生理学的異常をもたらさず、ラットは生殖可能でした。 トリプタミン依存性酵素活性に対する INMT 欠失の影響を決定するために、WT ラットと KO ラットの両方の脳および肺組織を使用して放射分析による酵素アッセイを実施しました。 ウサギ肺組織抽出物をポジティブコントロールとして使用しました（図2d）。 これらの高感度アッセイは、放射性標識 (C14) メチル基の C14-SAM から基質への移動に依存しており、液体シンチレーション カウンティングによって活性が測定されます。 データは、ラット INMT の欠失が、脳または肺抽出物のトリプタミンをメチル化する能力に検出可能な影響を及ぼさなかったことを示しています。

トリプタミンの酵素的メチル化は、WT ラットと INMT-KO ラットの間で異なりません。(a) ラット INMT の遺伝子構造 (エクソンは黒のボックスで表されます)。 INMT ガイド RNA (gRNA) の位置と配列は赤い三角形で示されています。 (b) KO の生成に関与する 2 塩基対の欠失は、野生型 (WT) 配列の下に示されており、gRNA の位置に下線が付けられています。 (c) WT には INMT (緑色のバンド) が存在するが、KO ラット肺組織には存在しないことを示すウェスタンブロット。 分子量マーカーのすべてのレーンを含む元の画像は、補足図 S1 として含まれています。 （ d ）ウサギの肺、ならびにWTおよびINMT-KOラットの両方からのラットの脳およびラットの肺からの組織抽出物を用いた放射性酵素アッセイ。 各点は、各遺伝子型について、ウサギ (n = 3) およびラット (n = 6) について、個々の動物からの 3 回の実験の平均を表します。 プロットには平均が表示され、標準偏差を示すエラーバーが表示されます。 CPM: 1 分あたりのカウント。 ウサギ肺組織抽出物 (n = 3) は、ラット組織より 20 倍を超えるトリプタミン依存性活性を示しました (平均比活性 [SA] = 322.2 ± 8.81、平均の 95% 信頼区間 [CI] = 300.3 ～ 344.0)。 トリプタミン依存性活性は、脳 (t = 0.30、平均差 = − 0.36、95% CI = − 3.05 ～ 2.33、p = 0.77) または肺組織 (t = 0.52、平均差 = −) において WT ラットと KO ラットの間で差はありませんでした。 0.25、95% CI = − 1.33 ～ 0.84、p = 0.62)。 脳では、平均 SA は WT で 14.68 ± 2.34、平均の 95% CI = 12.22 ～ 17.13、KO で 14.32 ± 1.76、平均の 95% CI = 12.47 ～ 16.16 でした。 肺では、平均 SA は WT で 6.36 ± 0.66、平均の 95% CI = 5.66 ～ 7.05、KO で 6.11 ± 0.96、平均の 95% CI = 5.10 ～ 7.12 でした。 トリプタミン依存性活性は、肺と比較して脳組織で有意に高かった（WT では t = 8.38、平均差 = 8.32、95% CI = 5.87 ～ 10.77、p = 0.0002、t = 10.04、平均差 = 8.21、95% CI = 6.31–10.11、KO の場合は p < 0.0001）。

WT および KO ラットの脳および肺組織からのトリプタミンメチル化活性を特徴付けるために、最初に薄層クロマトグラフィーを使用して反応生成物を評価し、追加の検証と定量を提供するために uHPLC-MS/MS を実装しました。 薄層クロマトグラフィーでは、トリプタミン、NMT、および DMT 標準により、それぞれ 0.65、0.55、および 0.47 の遅延係数 (RF) 値が得られました (図 3、左)。 大腸菌で発現させたウサギグルタチオン-S-トランスフェラーゼ-INMT 融合タンパク質 (GST-INMT) からの抽出物 (ポジティブコントロール) は、NMT (RF = 0.53) と DMT (RF = 0.46) の両方で等像的な 2 つの異なるスポットを生成しました。 WT ラットと KO ラットの両方の脳と肺を含むラット組織は、NMT または DMT のいずれでも等像的なスポットを生成しませんでしたが、RF 値が 0.67 (上) および 0.37 (下) の 2 つの特徴的なスポットを生成しました。 トリプタミンを省略したすべての条件では、検出可能なメチル化活性が示されませんでした。

WT ラットおよび KO ラットの脳および肺組織は、NMT または DMT と等像的ではない生成物を生成します。 N-ブタノール:酢酸:水(12:3:5)の移動相を使用してシリカゲルプレート上で分離した後、WTおよびKOラットの脳および肺組織からの抽出物を使用した放射酵素アッセイ製品の蛍光イメージングスキャン。 トリプタミン、NMT、および DMT を含む標準混合物 (Std) は、これらのクロマトグラフィー方法を使用して明確に分離されました (一番左のレーン)。 グラフのトリミングおよび未処理の蛍光イメージング スキャンは、補足図 S2 として含まれています。

組織抽出物アッセイからの反応生成物の uHPLC-MS/MS 分析 (表 1) では、NMT レベルのバックグラウンド コントロールとして機能するために、各条件の対応する組織からトリプタミンを省略しました。

ウサギ肺組織抽出物を陽性対照として使用したところ、これらの抽出物がバックグラウンドレベルのほぼ 300 倍のレベルで NMT を生成し、(平均 ± 標準偏差) 0.57 ± 0.18 nM のレベルで DMT が生成されたことが結果から示されました。 この活性は、反応混合物へのトリプタミンの添加に依存していました。 しかし、WTラットとKOラットの両方からの脳および肺組織は、トリプタミン依存性のNMTまたはDMTの産生を示さなかった。 これらの結果は、薄層クロマトグラフィーの所見と一致しており、これらのアッセイ条件下では、NMT および DMT がラットの脳または肺組織に存在する酵素によって生成されないことが確認されています。

組換えラット、ウサギ、およびヒト GST-INMT 融合タンパク質を発現する大腸菌細胞からの抽出物を、これらの各酵素のトリプタミン依存性活性の放射定量化に使用しました (図 4)。 これらのデータは、ウサギとヒトの両方の INMT の強力なトリプタミン依存性活性を実証し、ラット INMT がトリプタミンのメチル化には十分ではないことを示しています。

ラットの INMT はトリプタミンのメチル化には不十分です。 (a) 大腸菌におけるラット、ウサギおよびヒト INMT の GST-INMT 融合タンパク質の発現を示すウェスタンブロット。 対照レーンは空のベクター GST の発現を示しており、INMT は存在しません。 ウェスタンブロットのトリミングされていない画像は、補足図S3として含まれています。 (b) GST 融合組換えラット、ウサギ、およびヒト INMT タンパク質を発現する大腸菌からの抽出物を用いた放射性酵素アッセイ。 プロットは、条件ごとに 6 回の個別の実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示します。 CPM = 1 分あたりのカウント。 このアッセイにより、ウサギ INMT (平均 SA = 350.9 ± 23.08、平均の 95% CI = 326.7 ～ 375.1) とヒト INMT (平均 SA = 171.8 ± 12.38、平均の 95% CI = 158.8 ～ 184.8) の両方のトリプタミン依存性活性が明らかになりました。 。 活性はヒト INMT と比較してウサギ INMT で有意に高かった (t = 16.75、平均差 = 179.1、95% CI = 154.3 ～ 204、p < 0.0001)。 ラット INMT の活性（平均 SA = 0.64 ± 0.21、平均の 95% CI = 0.42 ～ 0.85）は有意に低かった（t = 3.68、平均差 = - 0.48、95% CI = - 0.77 ～ - 0.19、p = 0.004 ）空のベクター GST 抽出物よりも優れています（平均 SA = 1.12 ± 0.24、平均の 95% CI = 0.86 ～ 1.37）。

大腸菌抽出物内の阻害因子がラットINMTの酵素活性の欠如に寄与している可能性を排除するために、ヒト胎児腎臓で発現させたFlagタグ付き組換えラット、ウサギ、およびヒトINMTタンパク質を使用して同様の実験を実施しました（ HEK) 293 セル (補足図 S4)。 ラットINMTがNMTをメチル化する能力があるかどうかを判断するために、GST-INMT融合タンパク質と基質としてNMTを使用してアッセイを実施し、同様の結果が観察されました（補足図S5）。 ラットの INMT は NMT に対する酵素活性を示さなかったが、ウサギとヒトの INMT は両方とも非常に活性が高かった。

蛍光イメージングと組み合わせた薄層クロマトグラフィーを使用して、上記の放射性組換え酵素アッセイのトリプタミン依存性反応生成物を同定した。 この溶媒系を使用すると、未標識のトリプタミン、NMT、および DMT 標準の純粋な溶液が明確に分離されました (図 5、左)。

ウサギとヒトは、ラットではなく、トリプタミンをメチル化して NMT と DMT を生成します。 N-ブタノール:酢酸:水 (12:3:5) の移動相を使用してシリカゲルプレート上で分離した後の、組換え GST-INMT 融合タンパク質を使用した放射酵素アッセイ製品の蛍光イメージング スキャン。 トリプタミン、NMT、および DMT を含む標準 (Std) 混合物は、これらのクロマトグラフィー方法を使用して明確に分離されました (一番左のレーン)。 標準品はそれぞれ 0.58、0.49、0.39 の RF 値を示しました。 ウサギ INMT、ヒト INMT、およびウサギ肺はそれぞれ、NMT と DMT の両方で 2 つのスポット等像を示しました。 ウサギ INMT の場合、NMT RF = 0.48 DMT RF = 0.41。 ヒト INMT の場合、NMT RF = 0.48、DMT RF = 0.41。 ウサギの肺 (陽性対照) の場合、NMT RF = 0.50 および DMT RF = 0.41。 空のベクター GST 調製物もラット GST-INMT も検出可能な産物を示さず、これはメチル化活性の欠如を示しています。 同じグラフのトリミングされていない、未処理の蛍光体イメージング スキャンが補足図 S6 として含まれています。

ウサギおよびヒトの組換え INMT タンパク質は強力なトリプタミン依存性メチル化活性を示しましたが、ラットの組換え INMT タンパク質はトリプタミンに対する検出可能な活性を示さなかった。

基質としてトリプタミンの代わりにNMTを使用した場合、同様の結果が観察されました（補足図S7）：ラットINMTはメチル化生成物を生成しませんでしたが、DMTと等像的なスポットの存在によって示されるように、ウサギとヒトのINMTはDMTを生成しました参考基準。 さらに、トリプタミン（図5）またはNMT（補足図S7）が省略されたすべての条件では検出可能なメチル化が示されず、反応が基質依存性であることが確認されました。

これらの発見の検証は、uHPLC-MS/MS を使用して実行されました。 組換え INMT 研究では、トリプタミンおよび SAM とインキュベートした空のベクター GST 形質転換大腸菌抽出物をバックグラウンド コントロールとして機能させ、これらのアッセイからの NMT 値をバックグラウンドとして定義しました。 これらのアッセイは、トリプタミン依存性の NMT および DMT の産生がウサギおよびヒト INMT でのみ発生することを示し、ウサギ INMT はバックグラウンドコントロールよりも 50 倍を超える NMT 産生を示し、ヒト INMT は 60 倍を超える高い NMT 産生を示しました (表 2)。 ウサギおよびヒトのＩＮＭＴとは対照的に、ラットのＩＮＭＴは、検出可能なトリプタミン依存性のＮＭＴまたはＤＭＴの産生を示さなかった。 これらのアッセイから得られた酵素的に生成された DMT の濃度は、ウサギおよびヒト INMT でそれぞれ (平均 ± 標準偏差) 0.23 ± 0.03 および 0.12 ± 0.06 でした。

基質としてトリプタミンの代わりにNMTを使用した場合、DMTの産生はウサギとヒトのINMTからのみ確認され、ラットのINMTは不活性でした（補足表S1）。 すべての条件において、トリプタミンまたは NMT 基質を省略すると、検出できないレベルの NMT および DMT 生成物が生じました。 分析物の正確な定量を提供することに加えて、これらの結果は放射酵素アッセイからの結果と密接に一致しており、薄層クロマトグラフィーの結果の検証を提供します。

我々は、トリプタミン依存性活性およびNMTおよびDMTの生合成に関連したINMTの包括的な多種研究と同様に、新規トランスジェニックINMT-KOラットモデルの作製を初めて報告する。 さらに、この研究は、組換えラット INMT のトリプタミン依存性活性を調査した最初の研究であり、現在ラットが脳における in vivo DMT 検出のモデル種であるため、この分野に関連性があります。 伝統的な技術（放射性酵素アッセイおよび薄層クロマトグラフィー）と最新の技術（CRISPR/Cas9 開発 INMT-KO ラット、複数種の組換え INMT 比較、および uHPLC-MS/MS）を組み合わせることで、INMT 機能の有益な特性評価が得られます。 、トリプタミンのメチル化、および内在性 DMT の生合成。

この研究の主な発見は、ラットの脳または肺組織におけるトリプタミンのメチル化およびNMTおよびDMTの生合成にはINMTが必要ではないということである。 高感度の放射酵素アッセイを使用して、WT ラットと KO ラットの両方の脳および肺組織からの抽出物が、これらのアッセイ条件下で同等レベルのトリプタミン依存性活性を示すことを示します。 大腸菌細胞で発現した組換えINMTを調べたところ、ラットINMTはトリプタミン依存性活性を示さないが、ウサギとヒトINMTは両方とも非常に活性であることが判明した。 これは、種間の INMT の配列相同性が低いためと考えられます。 ウサギとヒトの INMT の配列はほぼ同一 (89%) ですが、ラットの INMT はどちらとも 57% しか相同しません。 まとめると、これらの結果は、ラット組織がトリプタミン依存性メチル化活性を示す酵素を保有しているが、その原因となる酵素が INMT ではないことを示しています。

蛍光イメージングと組み合わせた薄層クロマトグラフィーにより、ウサギ肺組織のメチル化生成物、ならびにウサギおよびヒトの組換え INMT が NMT および DMT と等像であることが明らかになりました。 しかし、ラット INMT では検出可能なメチル化生成物の生合成は起こらず、ラット INMT がトリプタミンのメチル化を触媒しないことが示されました。 興味深いことに、放射分析の結果と同時に、WT ラットと KO ラットの脳と肺からの組織抽出物は同等のトリプタミン メチル化活性を示し、薄層クロマトグラフィーにかけると 2 つの特徴的なスポットが生成されました。 ただし、これらのスポットはどちらも NMT または DMT と等像的ではありませんでした。 これらの結果は、トリプタミンをメチル化する酵素の正体は INMT ではないという結論を裏付け、さらにその未確認の酵素反応の生成物が NMT でも DMT でもないことを示しています。 最後に、uHPLC-MS/MS 実験により、薄層クロマトグラフィーの結果が再現され、検証されました。ウサギの肺、組換えウサギおよびヒト (ラットではない) INMT は、これらのアッセイ条件下で NMT および DMT を生成でき、脳および肺からの組織抽出物も生成できます。 WT ラットと KO ラットは NMT も DMT も産生しません。 DMT が複数のグループによってラットの脳で独立して検出されたという事実 6,15,16,17,18 と併せて総合すると、これらの結果は、NMT と DMT の代替生合成経路がラットの脳および肺組織に存在することを示唆しています。ネズミ。 したがって、トリプタミンをメチル化して NMT および DMT を生成できる、独特の哺乳類 N-メチルトランスフェラーゼが存在する可能性があります。

トリプタミンを修飾する複数の酵素が存在する可能性を裏付ける生化学的証拠があります。 19614 年のアクセルロッドの先駆的な研究では、ウサギの肺組織から採取した粗抽出物を利用して、酵素アッセイ法では比較的一般的なトリプタミンのメチル化活性をアッセイしました。 その後 30 年間にわたる INMT 研究の大部分は、いわゆる INMT アッセイのタンパク質源として粗組織抽出物または部分精製組織抽出物を使用した同様の戦略を利用しました。 実際、より洗練されたタンパク質精製方法が利用可能になるにつれて、より最近の研究では、トリプタミンメチル化活性を有する特徴的なタンパク質が存在する可能性が高いことに注目しています。 Portaらは、部分的に精製されたウサギ肺抽出物を使用して、 は、同様の酵素動態を有するが、独特の等電点と最適pH 23を有する、2つの特徴的なINMT様トリプタミンメチル化タンパク質を記載した。 さらに、Ansher と Jakoby は、精製ウサギ肝臓抽出物から「メチルトランスフェラーゼ A」および「メチルトランスフェラーゼ B」とラベル付けされたものを特定しました 19。 これら 2 つの形態の INMT はトリプタミンメチル化活性を示し、分子量は同じでしたが、等電点と基質相互作用が異なりました。 我々の結果は、別のトリプタミンメチル化酵素が存在するかどうかを決定するために、ラットとヒトの組織で同様の研究を行う動機となった。

インビトロ条件下での個々の酵素の挙動は、pH、温度、イオン強度、アッセイ成分の濃度、緩衝液組成、直接ではないさまざまな補因子や成分の相互作用など、多くの実験変数に大きく依存することはよく知られています。反応に関与する24。 したがって、現在のインビトロ条件下では、ラットの脳および肺からの粗抽出物中でトリプタミンがメチル化されてNMTおよびDMTを形成することは不可能であると結論付けるのが妥当である。 代わりに、これらの条件は別の酵素の活性を促進し、図 3 に示す未確認生成物の生成に寄与しました。いくつかの研究では、ラットの脳における内因性 DMT の存在を実証するために in vivo アプローチが利用されています 6,15,17。 １８、２５は、ラットの脳組織におけるトリプタミンのメチル化のための生体内生理学的条件の重要性を強調している。 したがって、代替アッセイ条件の探索またはより徹底的な酵素スクリーニングにより、ラット組織における NMT および DMT の検出可能な生成がもたらされるのではないかと我々は推測しています。 これらの研究は、内因性 DMT の機能、制御、生合成経路をより深く理解するために不可欠です。

WT および KO ラット組織の脳および肺抽出物から生成される生成物の正体は現在不明ですが、これらの化合物の候補として考えられるのは、β-カルボリンおよびそれらに関連するアルカロイドである可能性があります。 β-カルボリンは、MAOI として機能する豊富な種類の化合物であり、三環式のピリジン縮合インドール骨格を特徴としています。 現在までに、500 を超える三環式 β-カルボリン アルカロイド モノマーが天然源から単離されています 26。 興味深いことに、トリプタミンは、トリプタミンの縮合とその後の閉環をもたらす化学反応であるピクテ・シュペングラー反応を介して、さまざまなβ-カルボリンの生合成における反応物質として機能することが長い間知られてきました27。 この反応は、非酵素的に、またはストリクトシジンシンターゼという酵素を介して酵素的に起こります28。 さらに、複数のβ-カルボリン アルカロイドがラットを含む哺乳動物の脳組織内に存在することが示されており 29、他の研究では、現在の研究と同様のアッセイを使用して β-カルボリン アルカロイドが形成される可能性について報告されています 30,31。 したがって、このメカニズムを念頭に置くと、ラットの脳および肺組織をトリプタミンとインキュベートした結果生じる生成物の正体は実際にβ-カルボリンアルカロイドである可能性があると仮説を立てるのが合理的です。 未知の反応生成物の正体に関係なく、これらのトリプタミン由来化合物の酵素による生成は明らかに INMT とは独立しており、哺乳動物においてトリプタミンを修飾する代替酵素が存在することが示されています。 これらの生成物とそれぞれの生合成経路を研究することで、哺乳動物の生理学におけるトリプタミン代謝産物のより完全な理解につながる可能性があります。 INMT-KO ラットが入手可能であれば、ラットにおけるこの酵素の内因性機能のさらなる理解が促進されるはずです。

結論として、我々の結果は、ウサギ INMT、ヒト INMT、およびウサギ肺組織抽出物はすべて、トリプタミンをメチル化して NMT と DMT の両方を形成できることを確認しています。 しかし、ラットの INMT およびラットの脳およびラットの肺からの組織抽出物は、現在研究されている条件下では NMT または DMT を生成しません。 むしろ、ラット組織はトリプタミンと相互作用して代替生成物を生成し、この反応には INMT は必要ありません。 ラット脳におけるインビボでの DMT の存在は十分に確立されているため、これらの結果は、哺乳動物の生理学における DMT の代替生合成経路が存在する可能性を示唆しています。

すべての動物を午前7時から始まる12:12の明暗サイクルで飼育し、食物と水を自由に摂取できるようにした。 この研究は、アナーバーにあるミシガン大学の動物管理使用委員会によって承認され、すべての方法は、その委員会の関連ガイドラインおよび推奨事項に従って実行されました。 INMT-KO ラットは、ミシガン大学のトランスジェニック動物モデルコアで CRISPR/Cas9 を使用し、INMT コード配列のエクソン 1 における 2 塩基対の欠失を介して F344 バックグラウンドで生成されました。 生後 21 日目にラットの子を離乳させ、標準的な DNA 抽出手順を使用して遺伝子型を特定するために尾の 1 mm 切片を滅菌チューブに収集し、ラットを WT (INMT + / +)、KO (INMT -/-) のいずれかとして識別しました。 、またはヘテロ接合性 (INMT + /-)。 WT ラットと KO ラットを比較する酵素アッセイでは、ヘテロ接合ラットを交配して両方の遺伝子型を含む同腹子を生産し、同腹子を WT ラットと KO ラット間の INMT アッセイ比較に使用しました。 ラットの除外基準は事前に定義されており、(1) ヘテロ接合遺伝子型、および (2) 明らかな行動的または生理学的異常が含まれていました。 したがって、研究にはWTラットとKOラットのみが使用され、屠殺時にはすべてのラットが健康でした。 すべての手順は、推奨される ARRIVE ガイドラインに準拠していました。

ラット (NM_001109022.1)、ウサギ (NM_001082043.1)、およびヒト (NM_006774.5) の INMT は、以下のプライマー配列を使用した PCR によって生成されました。ヒトのセンスおよびアンチセンス プライマーは 5'-AAAAGGATCCATGAAGGTGGCTTCACTGGG-3'、およびそれぞれ 5'-AAAAGAATTCTCAGGGCCCAGGCTTCTTGCG-3'。 ウサギのセンスおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ 5'-AAAAGGATCCATGGAGGGCGGCTTCACGGG-3' および 5'-AAAAGAATTCTCAGGACCCCGGCTTCTTGC-3' でした。 ラットのセンスおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ 5'-AAAAGGATCCATGGCAGGCAAGGTATACATG-3' および 5'-AAAAGAATTCTCAGGCACTGGGACCCTTTCG-3' でした。 各クローンは、BamH I および EcoRI 制限酵素を使用して pGEX-2TK 細菌発現ベクターに組み込まれました。 これらのベクターには、組換え INMT の溶解性と発現を増加させる働きをするグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 遺伝子が含まれていました。 大腸菌で発現させるために、クローンをBL21 (DE3) (Sigma Aldrich #CMC0015) に形質転換しました。 コロニーを 25 mL LB アンピシリンに 37 °C で 15 ～ 18 時間接種しました。 次いで、細胞を回収し、ペレット化し、上清を廃棄し、細胞溶解および透析の前に細胞を-20℃で凍結した。

脳および肺の抽出物を得るには、ラット (10 週齢) を CO2 吸入によって安楽死させ、首を切り落としました。 全脳と肺を素早く抽出し、さいの目切りにして、微量遠心管内のドライアイス上で直ちに凍結させました。 凍結ウサギ肺組織は、Pel-Freez Biologicals から入手しました。 凍結組織 (ラットの脳または肺、またはウサギの肺) および凍結 GST-INMT ペレットを 5 倍量の 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.9) に再懸濁し、6000 rpm で 3 回のバーストでホモジナイズしました。 ホモジネートを 100,000 g、4 °C で 60 分間遠心分離しました。 12 kDa 分子量カットオフの Pur-A-Lyzer Maxi 透析キット (Sigma Aldrich) を使用して、4 時間ごとに 3 回緩衝液を交換しながら、上清を 100 容量のリン酸ナトリウム緩衝液で 4 °C で一晩透析しました。 透析した上清のタンパク質濃度を Bradford Assay (Bio-Rad) によって測定し、残りの画分を等分して、酵素アッセイのために -80 °C で保存しました。 INMT 発現を確認するために、すべての組織と GST-INMT 抽出物をウェスタンブロットによって分析しました。 各タンパク質 30 μg を、β-メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝生理食塩水中で変性し、100 °C で 5 分間煮沸しました。 サンプルは標準的な SDS ポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロースにエレクトロブロットされました。 ウェスタンブロット分析は、ラット INMT (GenScript から特注したウサギ ポリクローナル)、チューブリン (Developmental Studies Hybridoma Bank からのマウス モノクローナル)、および GST (Fisher からのマウス モノクローナル) 抗体を使用して実行され、続いてウサギに対する赤外蛍光標識二次抗体とインキュベートされました。およびマウス（Li-COR）。 バンドは、Li-COR Odyssey 赤外線スキャナーを使用して検出されました。 得られたウェスタンブロット画像 (図 2 および 4) は、未処理の生ファイルのトリミングされたバージョンとして表示されます。 トリミングされていない画像については補足資料を参照してください。

酵素アッセイのタンパク質源には、組織抽出物 (ウサギの肺、ラットの脳、ラットの肺) および組換え GST-INMT (ラット、ウサギ、およびヒト) が含まれていました。 酵素アッセイは、約 50 µg のタンパク質を含む 1.5 mL 微量遠心管で実施しました (ストックタンパク質濃度の範囲は、ラットの脳では 4.1 ～ 6.9 mg/mL、ラットおよびウサギの肺では 10.6 ～ 14.6 mg/mL、および 0.75 ～ 1.05 mg/mL)組換え GST-INMT の場合）。 放射酵素アッセイでは、リン酸ナトリウム緩衝液を使用した最終反応量 150 μL で、4 mM トリプタミン (Sigma Aldrich) または NMT (Cayman Chemical) と 2.3 nmol C14-SAM (比放射能 52.6 mCi/mmol、PerkinElmer Inc.) を使用しました。 アッセイ成分を合わせて 37 °C で 60 分間インキュベートし、1 mL の氷冷 0.5 M ホウ酸緩衝液 (pH 9.5) を加えて反応を停止しました。 反応生成物を抽出するために、反応混合物を 6 mL の 97:3 トルエン:イソアミルアルコール (T:IAA) 溶液とともに 15 mL ファルコンチューブに移し、チューブを 5 秒ずつ 3 回ボルテックスし、1,650 g で遠心分離しました。 3分定量化のために、4 mLのT:IAA有機層を5 mLのシンチレーションカクテル(Ultima Gold; PerkinElmer Inc.)を含むシンチレーションバイアルに添加し、放射能をBeckman LSシンチレーションカウンターで1分間計数した。 基質（トリプタミン）を省略したチューブをバックグラウンド対照として使用した。 比活性 (SA) は、各条件の 3 つのバックグラウンド コントロールの平均 CPM を減算し、得られた CPM 値を使用したタンパク質の量 (μg) で割ることによって計算されました。 結果は、遺伝子型ごとに n = 6 匹のラットの脳および肺組織の両方における 3 回の実験の平均として、および各 GST-INMT 条件について 6 回の反復実験として表示されます。 uHPLC-MS/MS分析による分析のために、非放射性アッセイを実施しました。 これらのアッセイでは、リン酸ナトリウム緩衝液を使用した最終反応容量 150 μL で 1 mM トリプタミンまたは NMT と 33 μM SAM を使用しました。 アッセイ成分を合わせて、37 °C で 60 分間インキュベートしました。 基質を省略したチューブをバックグラウンドコントロールとして使用した。 反応生成物は、1 mL の T:IAA を加えてボルテックスすることにより直ちに抽出されました。 950 μL の有機相を新しい 1.5 mL チューブに移し、有機溶媒をベンチトップ VacuFuge™ 濃縮装置 (Eppendorf) で室温で 2 時間蒸発させました。 得られた生成物を1 mLの30%メタノールに再懸濁し、3分間ボルテックスし、uHPLC-MS/MSによって分析しました(以下の「方法」を参照)。 基質として NMT を含むサンプルを、30% メタノールでさらに 10 倍に希釈しました。 組織抽出物を用いたアッセイは各ラットについて 2 回実行し (遺伝子型ごとに n = 6)、GST-INMT 抽出物を用いたアッセイは各条件について 3 回実行し、空のベクター GST 変換をバックグラウンド コントロールとして使用しました。 NGG が実施した uHPLC-MS/MS 分析では、サンプルの同一性を LC によってブラインド化しました。

生成物分析では、放射性酵素アッセイについて上記した方法を使用して、すべての組織および組換え GST-INMT に対して INMT アッセイを繰り返しました。 反応物は、1.5 mL 微量遠心分離管中でトリプタミンの有無にかかわらず 4 つずつ準備されました。 生成物を抽出するために、アッセイ直後に 1 mL の T:IAA を反応チューブに加えました。 チューブを5秒間隔で3回ボルテックスし、13,000 rpmで3分間遠心分離しました。 次に、上清を清潔な微量遠心管に移し、エッペンドルフ サーモミキサー中で 50 °C で一晩蒸発させました。 各条件の 4 つの反復から得られた生成物は、100 µL T:IAA を使用して一緒にプールされました。 スポットする前に、シリカゲル薄層クロマトグラフィー プレートを 90 °C のオーブンで 30 分間活性化し、ガラス薄層クロマトグラフィー展開タンクに N-ブタノール、酢酸、および酢酸からなる 50 mL の移動相をあらかじめ充填しました。水（12:3:5）。 プレートに、T:IAA 中のトリプタミン、NMT、および DMT それぞれ 0.5 μg を含む標準混合物と、プールした酵素アッセイ反応生成物 50 μL をスポットし、すべて 1.0 cm 離してスポットしました。 プレートを現像タンクに約 2 時間置き、その後取り出して 1 時間自然乾燥させました。 トリプタミン、NMT、および DMT 標準 (紫外光下で表示可能)、ならびに生成物起源および溶媒フロントは、C14-SAM の希釈混合物でオーバースポットされ、これらの位置が蛍光イメージングで見えるようになりました。 現像のために、プレートをラップで包み、蛍光体スクリーン (Molecular Dynamics) 内に 72 時間保管しました。 スクリーンのイメージングは​​、1,000v の光電子増倍管感度、通常のスキャン速度、および 100 μm のピクセル サイズを備えた Amersham タイフーン フォスフォイメージャーを使用して行われました。 得られた画像 (図 3 および 5) は、スポッティング ラインと溶媒フロントを除外するためにトリミングされ、Amersham タイフーン イメージング ソフトウェアを使用して全体的に修正され、反応生成物の可視性が向上しました。 生の、トリミングされていない、未処理の画像が補足資料で提供されます。 遅延係数 (RF) 値は、溶質の移動距離を溶媒フロントの移動距離で割ることによって決定されました。

放射分析アッセイは、極めて低レベルの酵素活性を検出できるという点で高感度ですが、反応生成物の正体に関する情報は得られません。 薄層クロマトグラフィーはさまざまな反応生成物の視覚化に役立ちますが、この技術には分解能が欠けていることがよくあります。 ただし、uHPLC-MS/MS は、分析対象物の同定において高レベルの感度と分解能の両方を提供し、分析対象物の分離、検出、および定量化のゴールドスタンダードとなります。 さらに、当社の uHPLC-MS/MS メソッドは、uHPLC による保持時間、前駆体イオンとプロダクト イオンの両方のトリプル四重極多重反応モニタリング、NMT および DMT のスパイク重水素化内部標準標準など、複数の技術を利用して分析物の同定を最終的に確認します。

NMT および DMT の濃度を決定するために、30% メタノール再懸濁液 (「酵素アッセイ」セクションを参照) 10 μL に、重水素化された 100 nM d3-NMT および d6-DMT (Toronto Research Chemicals) を含む混合物 10 μL をスパイクしました。抽出効率と質量分析イオン化効率を正規化するための内部標準。 NMT と DMT のキャリブレーション溶液は 30% メタノールで調製され、NMT については 0.625 ～ 125 nM、DMT については 0.125 ～ 25 nM のキャリブレーション範囲が作成されました。 キャリブレーション標準には、上記のように内部標準溶液を添加し、毎日の分析の前に注入しました。 6 点検量線は、線形回帰による検量線と内部標準のピーク面積比に基づいて決定されました。 すべてのサンプルと標準は、TSQ Quantum Ultra トリプル四重極質量分析計 (Thermo Fisher Scientific、カリフォルニア州サンノゼ）。 移動相 A は、0.15% (v/v) ギ酸を含む 10 mM ギ酸アンモニウム水溶液でした。 移動相 B はアセトニトリルでした。 使用した勾配は次のとおりです。初期は 5% B。 0.01 分、19% B; 0.68 分、26% B、1.05 分、75% B; 1.8 分、100% B; 2.2 分、100% B; 2.3 分、5% B; 3.0 分、5% B、600 μL/分。 サンプル注入量は 7.5 µL で、オートサンプラーは周囲温度に維持され、カラムは静止空気モードで 30 °C に維持されました。 NMT は 0.92 分で溶出し、DMT は 0.96 分で溶出しました。 エレクトロスプレー イオン化は 4 kV のポジティブ モードで使用されました。 キャピラリー温度は 325 °C、気化器温度は 300 °C、シース ガス圧力は 50、補助ガス圧力は 10 でした。イオンはタンデム質量分析モードで検出されました。 4 つの分析物すべてのスキャン パラメーターは次のとおりです。 NMT: プリカーサー イオン m/z = 175、プロダクト イオン m/z = 143.8、衝突エネルギー = 14、チューブ レンズ = 53。 d3-NMT: プリカーサー イオン m/z = 178、プロダクト イオン m/z = 143.8、衝突エネルギー= 14、チューブレンズ = 65。DMT: プリカーサーイオン m/z = 189.1、プロダクトイオン m/z = 144.1、衝突エネルギー = 19、チューブレンズ = 49。 d6-DMT: プリカーサーイオン m/z = 195.1、プロダクトイオンm/z = 144.1、衝突エネルギー = 19、チューブレンズ = 49。XCalibur 3.0 MS ソフトウェアを使用して自動ピーク積分を実行し、すべてのピークを視覚的に検査して適切な積分を確認しました。

統計分析は、GraphPad Prism バージョン 9.4.1 (カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して実行されました。 放射酵素アッセイでは、すべてのデータが正規分布を示し、シャピロ・ウィルク正規性検定によって確認されました。 すべての統計比較には、対応のないパラメトリックな両側 t 検定をウェルチ補正とともに使用しました。 本文では、p 値、平均 ± 標準偏差、差の平均、95% 信頼区間 (CI)、および t 値が報告されます。 すべてのテストで α = 0.05。

データおよび試薬は、責任著者 (JB) からの合理的な要求に応じて入手可能です。

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この研究は、分子統合生理学部門、MCube 助成金 (JB、MMW、および YK へ)、ミシガン大学からの意識科学センターからの助成金 (JB へ)、および PharmaDrug からの助成金によって支援されました。 Inc.（JBへ）。 uHPLC-MS/MS 技術についてアドバイスをいただいた Brian Shay 博士、蛍光イメージング研究をサポートしていただいた Gregg Sobocinski 氏、実験方法と結果の解釈について貴重な洞察とアドバイスを共有していただいた Steven Barker 博士に感謝します。 MMW は、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 NS099160 および VA 助成金 BX003824 によって支援されました。 RTK は NIH RF1NS128522 によってサポートされました。

これらの著者は同様に貢献しました: Nicolas G. Glynos と Lily Carter。

米国ミシガン州アナーバーのミシガン大学分子統合生理学教室

ニコラス・G・グリノス、リリー・カーター、マイケル・M・ワン、ジモ・ボルジギン

ミシガンサイケデリックセンター、ミシガン大学、アナーバー、ミシガン州、米国

ニコラス・G・グリノス、ジョージ・A・マシュール、ジモ・ボルジギン

ミシガン大学神経内科、アナーバー、ミシガン州、米国

ス・ジョン・リー、マイケル・M・ワン、ジモ・ボルジギン

退役軍人アフェア アナーバー ヘルスケア システム、米国ミシガン州アナーバー

ス・ジョン・リー & マイケル・M・ワン

ミシガン大学化学科、アナーバー、ミシガン州、米国

キム・ヨンス & ロバート・T・ケネディ

ミシガン大学麻酔科、アナーバー、ミシガン州、米国

ジョージ・A・マシュア

神経科学大学院プログラム、ミシガン大学、アナーバー、ミシガン州、米国

ジョージ・A・マシュール、マイケル・M・ワン、ソン・ボルジギン

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JB は研究のアイデアを考案し、実験を指揮しました。 LC と NGG は、JBSJL の支援を受けて実験を実施し、データを分析しました。 組換えタンパク質の研究は、SJL と MMW によって指示およびサポートされました。 uHPLC-MS/MS メソッドの開発と分析は、YK および RTK によってサポートされました。 INMT-KO ラットの生成は、GAM によってサポートされました。 NGG は JB と LC の協力を得て原稿を書きました

ジモ・ボルジギンへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

グリノス、NG、カーター、L.、リー、SJ 他インドールエチルアミン N-メチルトランスフェラーゼ (INMT) は、ラットの内因性トリプタミン依存性メチル化活性には必須ではありません。 Sci Rep 13、280 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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受信日: 2022 年 9 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 4 日

公開日: 2023 年 1 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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