人工粒子状物質の確立

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5955 (2023) この記事を引用

330 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

環境リスク要因である粒子状物質 (PM) は、呼吸器疾患などの健康リスクと関連しています。 この研究は、人工 PM (APM) による PM 誘発性肺損傷の動物モデルを確立し、毒物学研究における APM の可能性を特定することを目的としました。 APM は 600 °C でグラファイトから生成され、エチレンと結合されました。 私たちはディーゼル排気微粒子（DEP）とAPMの組成を分析し、曝露に応じて肺における毒性とトランスクリプトームプロファイリングを比較しました。 動物研究では、C57BL/6 雄マウスにビヒクル、DEP、または APM を気管内投与しました。 DEP または APM は、ビヒクル対照と比較して、相対的な肺重量、炎症細胞数、炎症性タンパク質レベルを増加させました。 組織学的評価では、DEP および APM マウスの肺において粒子色素肺胞マクロファージの増加と軽度の炎症が示されました。 唯一の APM グループでは、一部の人の肺で肉芽腫性炎症、肺線維症、および粘膜過形成が観察されました。 これは、動物モデルにおける DEP と APM の間の肺毒性を比較する最初の研究です。 我々の結果は、APMが異なるAPM用量に応じてさまざまな肺疾患を誘発する可能性があることを示す毒物学研究において、APMで処理した動物モデルがPMの有害な影響の理解に貢献する可能性があることを示唆しています。

2013 年、粒子状物質 (PM) は、世界保健機関の国際がん研究機関によってグループ 1 の発がん物質として分類されました1。 PM は、空気中に浮遊する固体および/または液体の有機および無機物質の複雑な混合物であり、有機炭素 (OC)、元素炭素 (EC)、多環芳香族炭化水素 (PAH)、水溶性有機イオン (塩化物、硝酸塩) が含まれます。 、硫酸塩、ナトリウム、カリウム、アンモニウム）、および自然大気中の金属2。 PM 画分の物理的および生物学的特性は、季節、地域、発生源によって異なります3、4、5、6、7。 高濃度の OC、EC、PAH は、暖かい季節、交通量の多い地域や夜間に発生します8,9。 健康への影響に関しては、周囲空気中の OC、EC、PAH を含む PM への曝露は、肺、肝臓、腎臓、心臓疾患の臨床症状を誘発し、悪化させます 8、10、11、12、13、14、15。 ほとんどの研究は疫学研究に焦点を当てており、大気汚染物質と救急外来の受診および入院との関係を示しています。 現在、ヒトにおける潜在的な毒性効果を試験し、関連するメカニズムを推測するには、生体内および体外研究などの毒性学的研究が必要です。 多くの研究者は、PM 曝露に関連する健康リスクを研究するために、標準標準物質 2975 (SRM2975、ディーゼル排気微粒子、DEP) を PM の成分として使用してきました。 DEP は産業用フォークリフトから排出され、PAH、ニトロ PAH、酸素化 PAH 誘導体、複素環式化合物、アルデヒド、脂肪族炭化水素が含まれます 16、17。 ただし、PM 曝露に関する毒性学的研究にはいくつかの制限があります。 特に高濃度での PM 曝露による吸入毒性などの肺毒性を試験するには、大量の DEP が必要です。

これは、PM 曝露の長期的な影響に関する研究に多額の費用がかかることにつながります。 さらに、PM による毒性学的研究は、さまざまな情報源のうち、DEP の毒性のみに焦点を当てて行われる場合があります。

この研究では、毒性研究にディーゼル排気微粒子 (DEP) の代わりに使用するために、実験室環境で人工 PM (APM) を合成しました。 私たちは、DEP と APM の間の OC/EC 比と PAH を分析し、呼吸器系の病理学的特徴を比較し、APM の可能性を評価するための in vivo 研究で気管内経路を介して APM と DEP に曝露した後の肺のトランスクリプトーム分析を実施しました。呼吸器毒性研究に使用します。

私たちの以前の研究では、DEP と APM の粒子サイズと形態を特徴付けました。 DEP と APM は一般に、それぞれ 600 nm と 30 nm より小さい18,19。 DEP は球状で不規則な凝集体で構成されており、APM は典型的なディーゼルすす粒子の形態を示しました 18,19。 本研究では、DEP と APM の組成を特定し比較するために、OC/EC 比と PAH を測定しました。 DEP と APM の OC/EC 比は、それぞれ 1.52 と 1.23 でした (図 1A)。 7 つの PAH の濃度は、DEP と APM を使用して測定されました。 フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ[a]ピレン、インデノ[1,2,3-cd]ピレン、およびベンゾ[g,h,i]ペリレンの濃度は、6.42、1.27、12.01、1.56、0.14、0.20でした。 DEP では 、0.14 μg/mL、APM ではそれぞれ 137.49、8.00、22.76、9.56、0.17、0.50、0 μg/mL でした。 フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレンの濃度は、APM では DEP よりも約 1.89 ～ 21.43 倍高かった。

DEP および APM での構成。 (A) OC/EC 比および (B) DEP および APM 中の PAH の濃度。 データは平均値 ± SD (n = 3) を表します。 OC有機炭素、EC元素炭素、PAH多環芳香族炭化水素、DEPディーゼル排気微粒子、APM人工粒子状物質。

VC グループでは体重に変化はありません。 DEP および APM グループでは、体重の減少が観察されました。 特に、APM グループでは、体重が大幅に減少しました (図 2A)。 相対肺重量は、VC グループと比較して、DEP および APM グループで用量依存的に統計的に増加しました (図 2B)。 相対肺重量は、DEP グループよりも APM グループの方が高かった。 しかし、VCマウスと比較して、DEPおよびAPMグループの相対的な胸腺および脾臓重量に差はありませんでした（図2C、D）。

(A) 身体および (B-D) 相対臓器重量、(E) 細胞集団、(F-J) 絶対炎症性細胞、および (K-O) ビヒクルの BALF におけるさまざまな炎症性サイトカインの産生の変化。 DEP、およびAPMを注入されたマウス。 臓器重量は以下の式により計算した：相対臓器重量＝臓器重量（ｇ）／最終体重（ｇ）×１００％。 データは平均 ± SD (グループあたり n = 4 または 5) を表します。 #p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001、または ####p < 0.0001 対 VC。 DEP ディーゼル排気微粒子、APM 人工粒子状物質、BALF 気管支肺胞洗浄液、SD 標準偏差。

我々は、DEP と APM が肺の炎症を引き起こすかどうかを判定し、DEP と APM に曝露した後の BALF 中の炎症性細胞の割合と数を比較しました。 まず、マウスの BALF における炎症細胞の割合を測定しました。 マクロファージは主に対照群で観察され、全細胞の 97.75% を占めました。 しかし、DEP グループと APM グループでは、マクロファージの割合の減少と好中球の割合の増加が一般的に観察されました。 さらに、DEP および APM に曝露すると、好酸球とリンパ球の割合がわずかに増加しました。 特に、好酸球の割合は、すべての用量において DEP 群よりも APM 群で高かった（図 2E）。 これらの結果は、DEP と APM が肺の細胞変化と炎症反応を誘発することを示しました。

次に、炎症細胞の割合を総細胞数で割ることにより、炎症細胞の絶対数を計算しました。 対照群と比較して、DEP または APM を点眼したグループでは、BALF 内の総細胞数とマクロファージ、好中球、好酸球、リンパ球などの炎症細胞の数が増加しました (図 2F-J)。 好酸球を除いて、DEP グループの BALF 内の総細胞数、マクロファージ、好中球、およびリンパ球の数は、用量に関連して徐々に増加しました。 APM 群の BALF における総細胞数および各種炎症細胞数の増加には用量依存性は観察されなかったが、いずれの用量においても DEP 群よりも APM 群の方が高かった。 特に好酸球数はAPM群のみ顕著に増加した。 これらの結果は、DEP と APM 曝露によって浸潤した BALF 中の炎症細胞の割合と数はわずかに異なるものの、DEP と APM の両方がマウスの肺の混合炎症細胞に浸潤することによって炎症反応を開始し、維持することを示しました。

DEP または APM を注入したマウスの BALF におけるさまざまな炎症性サイトカインのレベルを評価しました。 DEP と APM は、インターロイキン (IL)-5、IL-6、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、CXC モチーフなどのさまざまな炎症性サイトカインのレベルの増加を誘導しました。 VC と比較した BALF のケモカイン受容体 1 (CXCL1)/KC (図 2K-O)。 IL-5、IL-6、TNF-α、MCP-1などの炎症性サイトカインレベルには統計的に有意な差はありませんでしたが、対照群と比較してDEP群では増加傾向が観察されました。 DEP は、BALF 内の CXCL1/KC レベルのみを有意に増強しました。 APM グループでは、炎症性サイトカインのレベルが大幅に増加しました。 DEP および APM 曝露による細胞割合の増加の結果と一致して、炎症性サイトカインの放出は DEP グループよりも APM グループの BALF で強かった。

DEP および APM を注入されたマウスの肺組織の組織病理学的特徴を特定し、比較するために、H&E、MT、および PAS 染色による組織学的評価を実施しました。 H&E 染色した肺切片から、DEP および APM の点滴注入により、一般に、軽度の肺炎症 (赤い矢印、図 3) とともに、用量依存的に粒子を含んだ肺胞マクロファージ (黒い矢印) の蓄積が生じることが明らかになりました。 APM を注入したマウスの一部の個体の肺では、H&E 染色、MT 染色、PAS 染色により肉芽腫性炎症、肺線維症、粘液細胞過形成 (図 4) が観察されました。 これらの所見は、肺切片の組織学的スコアリングによって確認されました (表 1)。 これらの結果は、DEP と APM の両方が肺胞マクロファージを介した急性肺炎症を誘発し、APM 曝露は DEP 曝露と比較してより重篤な肺疾患を引き起こす可能性があることを示しました。

DEP または APM 曝露時の肺組織の組織学的変化。 ビヒクル、DEP、または APM を点滴注入されたマウスから得られた肺の代表的な H&E 染色スライド。 黒と赤の矢印は、それぞれ粒子色素肺胞マクロファージと炎症細胞浸潤を示します。 DEP ディーゼル排気微粒子、APM 人工粒子状物質、H&E ヘマトキシリンおよびエオシン。

ビヒクルおよびAPMを点滴注入されたマウスから得られた肺の代表的なMTおよびPAS染色スライド。 黒い矢印は粘液細胞過形成を示します。 MT マッソンのトリクローム染色、PAS 過ヨウ素酸シッフ、APM 人工粒子状物質。

我々は、DEP または APM によって変化した遺伝子発現プロファイルを決定し、DEP および APM 処理に応答して誘発される遺伝子発現の損傷関連変化を比較するための遺伝子オントロジー (GO) 用語を同定しました。 トランスクリプトームプロファイリングでは、DEP 注入群と APM 注入群で異なる遺伝子発現パターンが示され、後者では前者よりも遺伝子変化に対する感受性が高いことが示されました。 合計で、DEP 曝露では 257、341、および 1794 個の遺伝子（DEG）の差次的発現が同定されましたが、対応する 3 つの用量での APM 曝露では、849、1176、および 1842 個の DEG が同定されました。 これらのうち、DEP および APM 曝露では、3 回の用量すべてで共通に変化した遺伝子がそれぞれ 40 および 400 個同定されました。 これらのうち、用量に関連した発現変化を示す遺伝子が、DEP 群では 31 個、APM 群では 242 個が選択されました。 また、PM によって変化する肺損傷の新規バイオマーカーを同定するために、DEP および APM 曝露群の両方で共通して変化する 31 個の遺伝子を同定しました。 倍率変化が最も高かった上位 10 遺伝子は、Gpnmb、Trem2、Clec4d、Slc26a4、Ear6、Cxcl5、Slc39a2、Cd300lf、Cxcr1、および Nup62-il4i1 でした。 9 つの遺伝子 (Gpnmb、Trem2、Clec4d、Slc26a4、Ear6、Cd300lf、Ctsd、Ptgir、および Tacc3) の発現は、DEP グループよりも APM グループで高かった。 DEP グループと APM グループで統計的に調節された遺伝子は、GO 生物学的プロセス (BP)、遺伝子とゲノムの京都百科事典 (KEGG) 経路、および疾患分析を通じて分類され、PM 曝露に関連する分子機構が分析されました。 DEP および APM によって統計的に変化した主要な BP および KEGG 経路（フィッシャーの正確検定 p 値 < 0.05）を表 2 に示します。全体として、17 の BP と 5 つの KEGG 経路が DEP 曝露グループで統計的に豊富であり、99 の BP および KEGG 経路が統計的に豊富でした。 APM 曝露グループでは 15 の KEGG 経路が統計的に豊富でした。 GO 分析により、APM によって変化した遺伝子は DEP によって変化した遺伝子よりも多くの BP および経路に関連していることが示されました。 DEP によって変化した遺伝子は主に、細胞外シグナル制御キナーゼ (ERK)1 および ERK2 カスケードの正の制御、腫瘍壊死因子への応答、ケモカインシグナル伝達経路などの炎症反応に関連していました (表 2)。 APM によって変化した遺伝子は、ERK1 および ERK2 カスケードの正の制御、NF-κB (NF-κB) の正の制御など、さまざまなシグナル伝達経路の制御に関与しているため、炎症反応、食作用プロセス、および線維化促進プロセスに関連していました。転写因子活性、プロテインキナーゼBシグナル伝達の正の制御、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）カスケードの正の制御、腫瘍壊死因子に対する細胞応答、食作用の正の制御、平滑筋細胞増殖の正の制御、線維芽細胞増殖に対する細胞応答因子刺激、Toll 様受容体シグナル伝達経路 (表 2)。

最後に、比較トキシコゲノミクス データベース (CTD) を使用して、PM によって変化した遺伝子をさらに分析し、肺疾患やその他の疾患における遺伝子変化の影響を解明しました。 DEP 曝露群と APM 曝露群でそれぞれ用量に関連した発現変化を示す 31 個と 242 個の遺伝子は、さまざまな気道関連疾患と関連しており、より多くの呼吸器疾患が APM 変化遺伝子と関連していました。 DEPで変化した31個の遺伝子は気道疾患、呼吸器過敏症、気管支疾患に関連し、APMで変化した242個の遺伝子は気道疾患、肺疾患、肺炎、気道感染症、肺新生物、気道新生物に関連していた（表） 3)。 表 2 および 3 に示すように、CTD および注釈付き遺伝子の数は、DEP グループよりも APM グループの方が高かった。 トランスクリプトーム解析において、我々の結果は、マウスの肺において、APM曝露がDEP曝露よりも多くのDEGの発現を誘導し、APMの発現が高いほど、DEP曝露よりもさまざまなBPに関与することにより肺疾患の重症度を誘導することを示した。

PM は、固体および/または液体の有機物質と無機物質の複雑な混合物であり、環境リスク要因と考えられています。 蓄積されている証拠は、PM が COPD、喘息、線維症、さらには癌を含む呼吸器疾患に関連していることを示唆しています。 現在、肺における PM 曝露の健康リスクを研究するために、多くの研究者が DEP を使用しています。これは、PM は季節、地域、発生源によって多様性があるため、再現性のある科学的結果を得ることが難しいためです。 さらに、動物や細胞の研究で毒性を調べるために天然PMを収集するのにも長い時間がかかります。 しかし、DEP に関連するコストが高いため、高濃度での長期間にわたる吸入毒性などの毒性情報は限られている可能性があります。 また、他のさまざまな要因を除外して、DEP の毒性のみを調査することもできます。 したがって、DEP に関連するこれらの制限を克服するために、我々は APM を生成し、その成分を分析し、DEP と APM を注入されたマウスの呼吸への影響を比較して、毒物学研究への適用可能性を確認しました。 さらに、マウスにおけるDEPおよびAPM曝露によって引き起こされる病理学的変化を説明するためにトランスクリプトーム分析を実行しました。

私たちは、PM2.5 の主要成分として、毒性学研究で広く使用されている DEP を選択しました。 以前の研究では、DEP と APM の間で粒子サイズと形態を比較しました。 APM は DEP サイズより小さい18、19。 DEP と APM は球状で、不規則な凝集体で構成されており、典型的なディーゼル煤粒子の形態です 18,19。

まず、本研究では、APM および DEP における PAH および OC/EC 比を分析しました。 PAH および OC/EC 比は、肺疾患の誘発および悪化と関連しています 8、9、10、11、12、13、14、15。 私たちの結果は、PAH レベルが DEP よりも APM の方が高く、OC/EC 比が DEP と APM で類似していることを示しました (図 1)。 IARC では、大気中の人為起源の発生源から放出される PAH は、人に対して発がん性がある、または発がん性がある可能性があるとして分類されています。 周囲の PAH は、肺がんの発症 20、21、22、23、24、および肺機能の低下、喘息の悪化、閉塞性肺疾患の罹患率および死亡率の増加などの非発がん性影響と関連しています 25、26、27。 我々は、粒子サイズと PAH 比に基づいて、APM が DEP よりも重篤な肺疾患を引き起こす可能性があると仮説を立てました。 この研究では、実験期間中の体重、臓器重量、細胞変化、BALF 中の炎症性サイトカインのレベル、および DEP または DEP の肺の組織学的変化を測定することにより、DEP の呼吸への影響を特定および比較する動物実験を実施しました。 APMを注入されたマウス。 我々は以前、DEP が 100 μg/マウス (5 mg/kg) DEP 点滴群において好中球性優勢肺炎症を誘発したことを示しました 28,29,30。 これに基づいて、DEP および APM の最高用量は 5 mg/kg として選択されました。 この研究では、マウスを気管内に DEP および APM に曝露しました。 DEP または APM を点滴注入したグループでは、VC グループと比較して相対肺重量の有意な増加が観察されました (図 2)。肺重量の増加は、血管透過性の増加と損傷した肺部位への炎症細胞浸潤を示しています 31。 この研究では、統計的に好酸球は唯一のAPM群のBALFに浸潤していましたが、マクロファージ、好中球、リンパ球などのさまざまな炎症細胞の割合は、DEPおよびAPMを注入したマウスの両方のBALFで有意に増加しました（図2）。 。 これらの結果は、DEP または APM を注入されたマウスの肺重量の増加に関連している可能性があります。 また、DEP および APM を注入したマウスの BALF におけるさまざまな炎症タンパク質も調べました。 ELISA により、BALF 中の IL-6、TNF-α、MCP-1、CXCL1/KC などの炎症性サイトカイン レベルが、DEP と APM を注入したマウスの両方の BALF で増加していることが示されました。 これらのタンパク質レベルは、DEP 曝露マウスよりも APM 曝露マウスの BALF で特に高かった (図 2)。 DEP グループの BALF では、IL-5 のタンパク質レベルは統計的に有意な変化なく徐々に増加しましたが、このレベルは APM グループでのみ有意に増加しました。 MCP-1 は、単球/マクロファージの遊走と動員の制御に重要な役割を果たす重要なケモカインです 32。 IL-6 と TNF-α は、PM 色素沈着した肺胞マクロファージから放出され、炎症反応に関与します 33。 MCP-1、IL-6、および TNF-α は、喘息や COPD などの肺疾患に関与する重要なケモカインまたはサイトカインです。 ケモカイン CXCL1/KC は、好中球の動員を担う主要な化学誘引物質であるため、急性炎症において重要な役割を果たします。 CD4+ Th2 細胞、マスト細胞、好酸球、および好塩基球から産生される IL-5 は、喘息などのアレルギー反応中の好酸球蓄積の最も強力なモジュレーターです 34。 これらの結果と一致して、組織学的評価では、DEP 群と APM 群の肺では血管周囲領域の混合炎症性細胞浸潤が一般的に観察されました (図 3、表 1)。 しかし、肉芽腫性炎症、肺線維症、および粘膜過形成が、APM グループのみの一部のマウスで観察されました (図 4、表 1)。 これらの結果は、DEP と APM の両方が混合炎症細胞の浸潤を伴う肺炎症を誘発し、炎症細胞浸潤の重症度とサイトカインレベルに応じて DEP よりも重篤な肺損傷を誘発する可能性があることを示しました。

次に、遺伝子発現の損傷に関連した変化と関連メカニズムを理解するために、DEP および APM に曝露された肺における遺伝子発現パターンを同定し、DEP における肺損傷の一般的な病理学的変化とさまざまな重症度を解明するために遺伝子発現と GO 分析に焦点を当てました。 - またはAPMを注入されたマウス。 我々は、APM曝露によって引き起こされるトランスクリプトーム変化はDEP曝露による変化よりもはるかに敏感であり、用量依存的にそれぞれ242個と31個の遺伝子の発現を誘導することを発見した。 さらに、in vivo モデルで DEP または APM 曝露によって一般的に観察される病理学的変化に対処するために、DEP および APM 曝露によって注釈が付けられた 31 個の一般的な遺伝子を特定しました。 DEP および APM グループの 31 個の共通遺伝子の中で倍率変化が最も高かった上位 10 個の遺伝子は、Gpnmb、Trem2、Clec4d、Slc26a4、Ear6、Cxcl5、Slc39a2、Cd300lf、Cxcr1、および Nup62-il4i1 でした。 それらのうち、9 つの遺伝子 (Gpnmb、Trem2、Clec4d、Slc26a4、Ear6、Cd300lf、Ctsd、Ptgir、および Tacc3) は、DEP 群と比較して APM 群で用量依存的に上方制御されました。 上位 9 つの遺伝子は、肺の炎症、喘息、COPD、肺線維症、肺がんにおいて重要な役割を果たしています35、36、37、38、39、40、41、42、43。 この研究では、組織学的評価により DEP グループと APM グループに共通の肺炎症が観察され、DEP グループと比較して APM グループの重症度が高かった。 肉芽腫性炎症、肺線維症、粘液細胞過形成などの病理学的特徴は、APM グループの肺でのみ観察されました。 したがって、我々の結果は、遺伝子発現レベルの変化が DEP および APM 誘発性の肺損傷の重症度に影響を与える可能性があることを示しました。

DEP および APM への曝露によって顕著な影響を受ける主要な BP および KEGG 経路を表 2 に示します。DEP および APM によって変化する遺伝子は、一般に、酸化還元プロセス、血管新生、ERK1 および ERK2 カスケードの正の制御などの免疫反応および炎症反応に関連しています。 、走化性、および腫瘍壊死因子に対する細胞応答。 これらの遺伝子発現の変化は、BALF における細胞の変化とサイトカイン分析の結果と一致しており、マクロファージ、好中球、好酸球、リンパ球、および IL-5、IL-6、TNF-α などのさまざまなサイトカイン レベルの増加を示しています。 MCP-1、CXCL1 (図 2)。 気道疾患カテゴリー内で DEP および APM 点滴注入によって変化する遺伝子と疾患の関係を解明するために、CTD を使用して遺伝子をさらに分析しました。 用量依存的に、DEP グループの 31 個の共通遺伝子はさまざまな気道関連疾患 (すなわち、気道疾患、呼吸器過敏症、気管支疾患; 表 3) に関与し、APM グループの 242 個の共通遺伝子はさまざまな気道関連疾患（気道疾患、肺疾患、肺炎、気道感染症、肺新生物、気道新生物など）に関連しています。表 3）。 DEP または APM を注入されたマウスで観察された病理学的特徴と同様に、APM グループで観察された遺伝子の変化は、DEP と比較してより多くの BP および疾患に関与していました。 これらの結果は、APM 曝露は DEP 曝露よりも肺損傷に関連する遺伝子発現変化に対してより敏感であることを示しました。

さらに、好酸球浸潤やIL-5産生の増加などの喘息の特徴がAPMグループのBALFで大幅に増強されたため、喘息に焦点を当てて、DEPとAPM曝露の間の主要な血圧を分析および比較しました。 さらに、APM グループの肺では粘膜過形成が観察されましたが、DEP グループでは観察されませんでした。 喘息は、喫煙、さまざまなアレルゲン、汚染物質などの遺伝的および環境的要因によって発生し44、好酸球の浸潤、Th2 サイトカインの産生亢進、B 細胞からの免疫グロブリン E (IgE) 産生の増加、血管の増加、気道平滑筋の量が増加し、MAPK や NF-κB を含む複数の経路を介して気道での過剰な粘液産生が起こります 45,46。 トランスクリプトームプロファイリングでは、DEP グループと APM グループの間の重要な BP を比較することにより、炎症反応、走化性、平滑筋細胞増殖の正の制御、一酸化窒素生合成プロセスの正の制御、内皮細胞分化の正の制御、喘息への反応などの代表的な喘息指標が得られます。インターフェロン-γ、ERK1およびERK2カスケードの正の制御、プロテインキナーゼBシグナル伝達の正の制御、およびMAPKカスケードの正の制御を介した免疫応答に関与するT細胞の分化は、APMグループでのみ確認されました。 これらの結果は、トランスクリプトーム分析および生体内研究の病理学的結果において、APM 曝露が喘息の特徴を誘発する可能性があることを示しました。

最後に、我々の研究では、直径100 nm未満の微粒子に属する約30 nmのAPMを生成しました。 それらは大気中に大きな割合で含まれています。 2018 年の初夏の中国の天津では、微粒子が周囲の PM の平均 33% を占めていました48。 欧州連合は、大気粒子の 70 ～ 80% が 100 nm 未満の小さな直径であることを明らかにしました 49。 呼吸経路はサイズに依存するため、小さな PM が肺に曝露されると、咽頭から肺胞に堆積します 50。 サイズが小さいと、毛細血管を容易に通過できるため、呼吸器系、心血管系、およびすべての臓器のリスクを引き起こします50。 別の研究で、APM を肺に点滴注入した後 (図示せず)、APM のサイズが小さいため、肺、心臓、腎臓、脾臓でこれらの微粒子が存在することを確認しました。 したがって、当社の APM は、肺やその他の臓器および関連メカニズムを含む疾患の発症、発症、悪化を含む微粒子の悪影響を調査するのに適しており、有用である可能性があります。

現在の研究にはいくつかの制限があります。 まず、APM の組成を分析し、空気中の PM の組成と比較し、PM のさまざまな成分を反映する動物モデルを確立し、毒性学的研究に使用する必要があります。 第二に、この研究では、DEP と APM が気管内経路で治療されました。 この方法は吸入の代替方法であり、肺内の異なる分布を明らかにできる可能性があります。 したがって、PM の毒性を試験し、APM を使用して PM 吸入による肺損傷やその他の障害における作用機序を実証するには、吸入に関するさらなる研究が必要です。

これらの制限にもかかわらず、現在の観察により、APMが用量を調節することによってさまざまな肺疾患を誘発する可能性があることが示され、APMに曝露された動物モデルが肺に対するPMの健康への悪影響の研究に役立つ可能性があることが明らかになった。

この研究では、実験室で生成された APM を使用して、PM 誘発性肺疾患の動物モデルを確立しました。 我々の結果は、DEP と APM の両方が炎症性肺損傷を誘発することを示しました。 ただし、重症度は DEP グループと比較して APM グループの方が高かった。 DEP に曝露されたマウスの肺では、わずかな肺炎症のみが観察されました。 興味深いことに、APM は、マウスにおける APM の異なる用量に応じて、軽度の肺炎症、肉芽腫性炎症、肺線維症、喘息などのさまざまな肺疾患を誘発しました。 これらの結果と一致して、トランスクリプトーム遺伝子プロファイリングでは、APM によって変化した遺伝子が DEP よりも傷害関連の BP、経路、および疾患に関与していることが示されました。 したがって、APM を注入した動物モデルは、さまざまな濃度変化に応じて PM 誘発性肺疾患の分子生物学的メカニズムを研究し、PM 関連肺疾患に対する予防および治療戦略の開発に役立つ可能性があると考えられます。

体重 20.31 ± 0.67 g の生後 7 週齢の雄 C57BL/6 マウス (Orient Bio、城南、韓国) を、温度 (22 ± 3 °C) および湿度 (50 ± 20%) に制御し、12 時間の光を当てて維持しました。暗いサイクル（150 ～ 300 ルクス）と食料と水道水への無料アクセス。 単一飼育されたマウスは 3 日間順応し、有害な臨床症状や正常な体重増加は示されませんでした。 すべての動物実験は、韓国毒性研究所の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認され (番号 2105-0030 および番号 2108-0032)、ARRIVE ガイドラインに従って実施されました51。

前臨床研究用の Pristima v.7.3 ソフトウェア プログラム (Xybion Medical Systems Corporation、米国ニュージャージー州モリス プレインズ) を使用して、マウスの体重を調整し、ランダムに 7 つのグループ (ビヒクル コントロールの場合は n = 4、その他のグループの場合は n = 5) に分けました。 7 つのグループは、次のような特定の曝露計画によって定義されました。DEP および APM 対照としての蒸留水 (DW) に対するビヒクル対照 (VC)。 3 回の用量 (1.25、2.5、および 5 mg/kg) のそれぞれの DEP (SRM 2975; 米国メリーランド州ゲイサーズバーグ、国立標準技術研究所)、および 3 回の用量 (1.25、2.5、および 5 mg) の APM /kg）。 ビヒクル、DEP、または APM の最後の点滴から 24 時間後に、臓器重量の測定、気管支肺胞洗浄液 (BALF) 中の細胞変化およびサイトカイン レベルの分析、および肺組織のトランスクリプトーム分析を伴う組織学的検査が行われました。

私たちの以前の研究では、室温、200 °C、400 °C、600 °C、800 °C などのさまざまな温度範囲でグラファイトからカーボン ブラック ベースの APM を製造しました18。 この研究では、APM は 600 °C でグラファイトから生成され、エチレンと結合して PAH のレベルが増加しました。 簡単に説明すると、DNP デジタル 3000 エアロゾル発生器 (Palas GmbH、ドイツ) を使用して人工 PM (APM) を生成しました。 高電圧下で、600 °C で 2 つのグラファイト電極間でジャンプ スパークが発生しました。 発電機を 2 つのグラファイト電極間で 2500 V、700 Hz の高電圧に維持した後、純粋なアルゴン (99.999%、7 LPM) と空気 (99.999%、10 LPM) をエチレンと混合した混合ガスを供給しました。 APM は、孔径 2 μm、直径 47 mm のテフロンフィルター (R2PJ047、PALL Corporation、米国) を使用してサンプリングされました 18,19。

さまざまな濃度のスクロース溶液を装置の校正に使用しました (N = 5、R2 = 1.00)。 APM サンプリングでは、有機化学物質を含まない石英ファイバー フィルター (QMA フィルター 25 mm、Whatman Inc.、米国) を使用しました。 APM および DEP の炭素質成分は、OC-EC Aerosol Analyzer Model 5 (米国オレゴン州ビーバートンの Sunset Laboratory) を使用して分析されました19。

米国環境保護庁がリストした優先汚染物質のうち、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ[a]ピレン、インデノ[1,2,3-c,d]を含む7つのPAHがこの研究の対象として選択されました。ピレン、ベンゾ[g,h,i]ペリレン。 校正と品質保証に使用される PAH 標準は、EPA 610 PAH 混合物 (Supelco、セントルイス、ミズーリ州、米国) をメタノールで希釈することによって調製されました52。

粒子状 PAH および n-アルカンは、ジクロロメタン溶媒を使用して 30 分間 2 回超音波処理することによって抽出されました。 抽出物は孔径 0.2 μm のシリンジフィルターを使用して精製しました。 この研究の PAH サンプルは、DB-5MS キャピラリー カラム 52 を備えた QP2010 ウルトラ MS 装置 (島津製作所、日本) に接続された QP-2010 ウルトラ GC 装置 (島津製作所、日本) を使用して分析されました。 詳細情報を表 4 に示します。

DEP および APM を、超音波処理プローブ (VC 505、Vibra-Cell™ Ultrasonic Liquid Processors、Sonics & Materials, Inc.、米国) を使用して 30 分間、2 mg/mL の濃度で分散させました。

気道は PM への最初の曝露経路であり、気管内投与は呼吸器毒物学研究用の PM 曝露動物モデルを確立するために使用されました。 １、５、８、１２、および１５日目に、５０μｌのＤＷに分散させたＤＥＰまたはＡＰＭ（１．２５、２．５、および５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに気管内投与した。 気管内投与の場合、吸入麻酔を使用してマウスを麻酔した。 投与前に、イソフルラン気化器を備えた小動物用ポータブル麻酔システム (L-PAS-02、LMSKOREA, Inc、城南、韓国) を使用して、イソフルランを動物室に送達しました。 次に、睡眠様状態に達するまで、マウスを動物室内で O2 中で送達される 2.5% イソフルラン (2 L/分) に曝露しました。 イソフルラン麻酔を受けたマウスを動物室から取り出し、マウスをボード上に横たわらせ、自動ビデオ注入装置を使用して直ちに投与を行った。 投与後、マウスは動き、完全に回復し、ケージに移されました。

16 日目に、屠殺したマウスの肺、脾臓、胸腺の重量を測定しました。

最後の DEP および APM 点滴注入から 24 時間後に、左肺を結紮し、0.7 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を含む気管チューブを使用して右肺をゆっくりと 3 回洗浄しました。 BALF 内の総細胞数は、NC-250 カウンター (ChemoMetec、Gydevang、デンマーク) を使用して測定しました。 異なる細胞を分析するために、Cytospin 装置 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して細胞塗抹標本を実行し、Diff-Quik 溶液 (Dade Diagnostics、Aguada、プエルト、米国) をロードしました。 洗浄後、スライドをマウントした。 スライドごとに合計 200 個の細胞をカウントしました。 また、サイトカインレベルを測定するために、BALF を 2000 rpm で 5 分間遠心分離し、上清を収集しました。

最後の DEP および APM 点滴注入から 24 時間後に、摘出した肺組織を 10% (v/v) 中性緩衝ホルマリンで固定しました。 スライドの準備のために、肺組織を脱水し、パラフィンに包埋し、4 μm の切片に切断しました。 染色前に、切片をキシレンで脱パラフィンしました。 これらは、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E; Sigma-Aldrich）、過ヨウ素酸シッフ（PAS; Sigma-Aldrich）、およびマッソントリクローム（MT; Sigma-Aldrich）溶液を使用して染色されました。 染色された切片を光学顕微鏡 (Axio Imager M1; Carl Zeiss、オーバーコッヘン、ドイツ) で分析しました。 負傷の程度は53,54点でした。

全RNAをTRIzol試薬(Invitrogen)で抽出した。 RNA の質と量は、それぞれ RNA 6000 Nano チップを備えた Agilent 2100 バイオアナライザー (Agilent Technologies、オランダ、アムステルフェーン) と ND-2000 分光光度計 (Thermo Inc.、デラウェア州、米国) で測定しました。 A260/A280 比 > 1.8 および RNA 完全性数 (RIN) 値 > 7 の RNA サンプルを分析に使用しました。

まず、QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc.、オーストリア) を製造元の指示に従って使用してライブラリを構築し、対照サンプルと試験サンプルを分析しました。 5' 末端にイルミナ互換配列を含むオリゴ dT プライマーを 500 ng の全 RNA とハイブリダイズさせ、逆転写しました。 RNA テンプレートが分解されると、5' 末端にイルミナ互換のリンカー配列を含むランダム プライマーによって第 2 鎖の合成が開始されました。 磁気ビーズを通して二本鎖ライブラリーを精製した後、クラスター生成に必要な完全なアダプター配列を追加するためにライブラリーを増幅しました。 ハイスループットシークエンシングは、NextSeq 500 プラットフォーム (Illumina, Inc., USA) でシングルエンド 75 シークエンシングとして実行され、最終ライブラリは PCR コンポーネントによって精製されました。

Bowtie2 によってアラインメントされた QuantSeq 3' mRNA-Seq リードでは、Bowtie2 インデックスがゲノム アセンブリ配列またはゲノムおよびトランスクリプトームとのアラインメント用の代表的な転写配列から生成されました。 アライメント ファイルは、転写産物の組み立て、その存在量の推定、および DEG の検出に使用されました。 DEG と RC (リード カウント) データは、Bedtools55 のカバレッジによる一意および複数のアライメントからのカウントに基づいて、および Bioconductor56 を使用した R 内の EdgeR による分位正規化法に基づいて、それぞれ処理されました。 遺伝子分類には、注釈、視覚化、統合発見データベース (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov/) および Medline データベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) を使用しました。

同様の肺毒性パターンを持つ動物群において DEP および APM によって変化した遺伝子を分類および比較するために、各遺伝子はその主な細胞機能によって適切なカテゴリーに割り当てられました。 トランスクリプトーム解析を実行するために、変化倍数 ≥ 1.5 および p 値 < 0.05 の組み合わせの下で DEG を定義しました。 DAVID およびパスウェイ分析を使用して、KEGG データベース (http://www.genome.jp/kegg/) から有意に過剰表現された GO 用語を決定し、DEG の重要なパスウェイをそれぞれ決定しました。 実質的な経路濃縮の同定と p 値は、それぞれフィッシャーの直接確率検定と BH 偽発見率 (FDR) アルゴリズムを使用して調整されました。 経路カテゴリーは FDR < 0.05 で報告されました。 さらに、CTD (http://ctdbase.org) を使用して、マウスにおける DEP および APM 曝露による疾患遺伝子相互作用を分析しました。 この研究では、DEP または APM 曝露時に用量依存的に変化した遺伝子が同定され、分析されました。

データは平均±(SD)として表した。 統計分析は、GraphPad Prism 8 ソフトウェア (GraphPad Software Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して実施されました。 データは、ブラウン・フォサイス検定またはバートレット検定を使用して均一性の分散について検査されました。 同種データは分散分析を使用して分析され、統計的比較は一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定を使用して実行されました。 p 値 < 0.05 は統計的有意性を示します。

動物実験は、韓国毒性研究所の IACUC によって承認されたプロトコール (番号 2105-0030 および番号 2108-0032) に従って実施され、すべてのガイドラインおよび規制に従って実施されました。

この研究の結果を裏付けるために使用されたデータは、要求に応じて責任著者から入手できます。

生物学的プロセス

比較トキシコゲノミクスデータベース

遺伝子の差次的発現

ディーゼル排気微粒子

蒸留水

元素炭素

細胞外シグナル調節キナーゼ

誤検出率

遺伝子オントロジー

ヘマトキシリンとエオシン

施設内動物管理利用委員会

京都の遺伝子とゲノム事典

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ

マッソンのトリクローム

NF-カッパB

有機炭素

多環芳香族炭化水素

リン酸緩衝生理食塩水

粒子状物質

読み取り回数

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、韓国毒物研究所 (助成金番号 KK-2203)、KIST 機関プログラム (大気環境研究プログラム、助成金番号 SK-2204; 2E31700-22-P008)、およびバイオおよび医療技術開発の支援を受けました。韓国政府 (MSIT) が資金提供する国立研究財団 (NRF) のプログラム (番号 2022M3A9E4082651)。

全北部吸入研究部、空気感染リスク因子吸入毒性センター、韓国毒性研究所、30 Baekhak1-Gil、Jeongeup、Jeongeup、全羅北道、56212、大韓民国

キム・ドンイム、ソン・ミギョン、チ・ウニョク、ヒョン・ジンソ、イ・キュホン

人間環境毒性学科、科学技術大学、大田、34113、韓国

ソン・ミギョン＆イ・ギュホン

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DIK は研究を設計し、マウスモデル実験、細胞数、タンパク質および IgE レベルを含む分子研究を実行し、データを解釈して原稿を執筆しました。 M.-KS はトランスクリプトーム プロファイリングを分析し、原稿を編集しました。 JEY はマウスモデル実験を実施しました。 HJSはOC/EC比とPAHsレベルを分析しました。 KL はデータを解釈し、原稿を編集し、この研究を監督しました。 著者全員が原稿の編集に協力しました。 著者全員が最終原稿を読み、レビューしました。

イ・キュホン氏への手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Kim、DI、Song、MK.、Yuk、JE 他マウスの病理学的変化とトランスクリプトームプロファイルの解析による人工粒子状物質誘発性肺疾患モデルの確立。 Sci Rep 13、5955 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29919-9

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受信日: 2022 年 11 月 3 日

受理日: 2023 年 2 月 13 日

公開日: 2023 年 4 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29919-9

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