クライオの自動ガラス化 - 成都極低温貯蔵有限公司

Nature Communications volume 13、記事番号: 2985 (2022) この記事を引用

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5 引用

13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

クライオ電子顕微鏡法におけるデータ収集と画像処理の速度と効率は、過去 10 年間で向上しました。しかし、凍結標本調製技術は遅れており、より高速で再現性の高い標本調製装置が必要とされています。ここでは、限られたユーザー操作のみを必要とする、高度に自動化されたサンプル処理を備えたガラス化装置を紹介します。さらに、この装置では、余分な液体が吸い取り紙ではなくチューブによる吸引によって除去されるため、光学顕微鏡を使用した薄膜の検査が可能になります。露点制御と組み合わせることで、制御された再現可能な方法での薄膜作製が可能になります。利点は、電子顕微鏡データを取得する前に、準備された低温試料の品質が特徴付けられることです。このデバイスの実用性と性能は、タンパク質懸濁液、脂質小胞、細菌細胞およびヒト細胞のガラス化によって得られた実験結果を用いて説明され、その後、単粒子分析、低温電子断層撮影法、および低温相関光学顕微鏡および電子顕微鏡を使用して画像化されます。

生体サンプルの急速凍結による硝子体水（非晶質氷）への低温固定は、タンパク質懸濁液、ウイルス、細菌、真核細胞などの生体サンプルの構造をほぼ完璧に保存できます。凍結固定には、氷 (結晶) の形成が防止されるように、十分に高い凍結速度 (>100,000 °C/秒) が必要です。その結果、水はガラスのような非晶質の準安定な過渡状態になります1。ガラス化を使用すると、タンパク質と細胞の構造を元の水和環境で原子分解能まで保存できます。ガラス化サンプルは、クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) に必要な真空条件に適合しており、光学式クライオ蛍光光学顕微鏡 (cryofLM)2 で研究することもできます。相関光電子顕微鏡法 (CLEM)3 は、EM の利点 (高解像度、構造コンテキスト) と、利用可能な幅広い光学顕微鏡技術の利点 (ライブイメージング、多用途の標識) を組み合わせたものです 4,5。

液体エタン、または極低温としてエタン/プロパン混合物を使用したプランジ凍結によるガラス化は、厚さ 10 ミクロンまでの生体サンプルの冷凍調製に実用的なアプローチであることが示されています 1,7。クライオ EM の場合、精製されたタンパク質とウイルスの懸濁液は数十ナノメートルの薄い水層に保存され、そこから SPA8,9 を使用して原子分解能の再構成を決定できます。細菌や厚さ数ミクロンまでの付着細胞などのより大きな構造もガラス化に適しています。分子分解能を備えた三次元再構成は、厚さ約 0.5 ミクロンまでのサンプルのクライオ電子断層撮影法 (cryo-ET) を使用して決定できます 10,11。液体層の厚さを最小限に抑えることが重要です。これは、サンプルの周囲の媒体が電子を散乱させ、画像の背景ノイズが増加し、それによって画像の信号対雑音比が低下し、結果として得られる 3 次元再構成で達成できる解像度が低下するためです。

EM 用の電子顕微鏡標本サポート (通常、直径 3.05 mm の銅グリッドでサポートされた穴の開いたカーボン層) 上に薄い液体サンプル層を生成するという重要なステップには問題があります。なぜなら、薄い水の層は本質的に不安定であり、液体サンプルの層を正確に制御する必要があるためです。水の層の厚さが難しい。空気中またはアルキルアミン 12,13 中でのグロー放電によって支持フィルムを親水性にすると、支持フィルム上に薄い液体層が形成され、湿気の飽和した環境が薄層の安定化に役立つことがわかりました。現在の一般的な手法は、数マイクロリットルの検体溶液をグロー放電した支持フィルムに塗布し、続いて濾紙を使用して余分な液体を吸い取り、その後プランジ凍結することです14,15。

ただし、この方法にはいくつかの課題があります。まず、水の層の厚さを制御し、グリッド全体での分布を決定することが困難です。水層の厚さは、支持体の特性、サンプル（種類、濃度、緩衝液、溶質など）、環境条件（温度と湿度）16など、多くの要因の影響を受けるため、最適なパラメーターは時間の経過とともに見つかることがよくあります。 - 凍結とクライオ EM による分析の反復サイクルを伴う試行錯誤が必要です。第二に、ほとんどのサンプルが吸い取り紙に吸収されるため、プロセス中に比較的大量のサンプルが失われ、結果としてグリッド上に残るサンプルは 1 パーミル未満になります 17。第三に、吸い取り紙の使用により、タンパク質の凝集や変性などの悪影響が生じる可能性があることが報告されています 18,19。さらに、手動によるサンプルの塗布、ピンセットの取り扱い、コンテナと異なる機械間の移動には時間がかかり、かなりのトレーニングとユーザースキルが必要です。現在の最先端のクライオ EM アプリケーションは、複数のグリッドへのロボットによるサンプルのロード、高度に自動化されたデータ記録 20,21、およびオンザフライ画像処理 22 を特徴としているため、サンプル前処理の速度と品質がボトルネックとなっています。全体的なプロセス。

ブロッティングに代わるサンプル前処理方法が提案および開発されており、これにはスプレー 23,24、インクジェット分注 25,26、マイクロキャピラリー書き込み 18、またはコンタクトピン印刷 27 を使用した最小限のサンプルの塗布が含まれます。これらの方法では、グリッドから余分な液体を除去する必要がなく、貴重なサンプルが効率的に使用されます。また、最近開発されたガラス化システムは高度に自動化されており、取り扱い、再現性、速度の問題に関連する手順が最小限に抑えられています。これらのシステムのいくつかの欠点は、グリッド上でのサンプルの拡散が空間的に制限されていること、または良好な拡散のためには特殊なグリッドが必要であることです28。さらに、ほとんどのシステムは懸濁液のガラス化には適していますが、付着細胞や細菌など、はるかに大きなサンプルで機能するように特別に設計されているわけではありません。さらに、これらの方法はいずれも、ガラス化とクライオ EM29 による品質評価の間の時間のかかるテストサイクルの解決に取り組んでいません。

ここでは、(i) クライオ顕微鏡を実行する前にガラス化標本の有用性を判断できる、(ii) あらゆる種類のサンプル (タンパク質、細菌、細胞) と互換性がある、(iii) クライオ顕微鏡用のガラス化デバイスの開発に着手しました。）制御可能なサンプル氷の厚さで再現可能な方法でグリッドを生成し、（iv）高度な自動化を備えています。当社は、グリッドの取り扱い、グロー放電、極低温液体の制御、サンプルの塗布など、サンプル前処理プロセスを広範囲に自動化したプランジ凍結装置を紹介します。この装置は、濾紙ではなく吸引によるサンプル除去を使用し、薄膜形成中にグリッドの目視検査を可能にします。光学顕微鏡による干渉パターンの観察とグリッドの露点温度制御を組み合わせることで、水層の厚さを正確に制御し、ガラス化の最適な瞬間を決定することができます。プランジ前の薄膜形成の光学モニタリングは、時間のかかるクライオ EM 分析の前に品質評価を行うための使用可能で信頼性の高い方法であることが証明されました。ここで報告する結果は、このデバイスが、単一粒子、断層撮影、および CLEM クライオ電子顕微鏡技術のタンパク質、リポソーム、ウイルス、細菌、および細胞のガラス化に使用できることを示しています。

Linkam プランジャーは、クライオ透過電子顕微鏡用に EM サポートグリッド上にサンプルを準備する高度に自動化されたデバイスです。特長としては、サンプルの塗布はグリッドをサンプル溶液に浸漬することで行い、サンプルの膜厚調整はサンプル溶液からグリッドをゆっくり引き上げ吸引することで行います。グリッドの空気露点温度は制御され、グリッド上の水層の厚さの形成は透過および/または反射光学顕微鏡によってライブで検査 (および記録) されます。この Linkam システムのワークフローは、保管ボックスからのグリッドの取り出し、グロー放電、サンプルの適用、液体の除去、ガラス化 (極低温溶液へのサンプルの突っ込み)、および極低温貯蔵ボックスへのロードという後続のステップがあるため、他のグリッド突入ワークフローとは異なります。は自動的に実行されます (図 1)。他のプランジ凍結装置、つまり Thermo Fisher Scientific Vitrobot や Leica EM GP では、最も重要なステップはブロッティングとガラス化 (試料の厚さを決定する) の間にあり、事前に設定された時間パラメータによって決定されます。 Linkam プランジャーでは、試験片の厚さの選択を除くすべてのステップが自動化されており、ガラス化の正確なタイミングが可能になります。

従来のプランジング装置のワークフローの概略図 (上)。グロー放電とサンプルの適用が、自動化されたサンプルの除去とその後のプランジングと統合されていません。 Linkam アプローチ (下) では、すべてのステップが自動化されたワークフローに統合されます。このアプローチでは、サンプルの適用はピペッティングではなくグリッドを溶液に浸すことによって実行され、サンプルの除去は濾紙での吸い取りではなくチューブでの吸引によって実行されます。薄層形成のプロセスはライブで追跡され、プランジのタイミングのみが手動で行われます。これは、従来のワークフローとはまったく逆です。

Linkam プランジャーの低温セクションの設計 (図 2) は、Linkam CMS 196 低温ステージの設計と関連しています 30。プランジャーには、(1) 液体窒素保存容器 (図 2a 左) が含まれています。（2）極低温容器、環境チャンバー、およびグロー放電ユニットを含む中央（覆われた）領域（図2b、c）。 (3) デジタルカメラと 10 倍の光学顕微鏡レンズ (それぞれコンテナの後ろと前)。 (4) 機械的に制御される可動ピンセット (チャンバー上)。これらはすべて (5) 電気ユニットとポンプを含むアルミニウムフレームに取り付けられています。 Linkam プランジャーとカメラは、制御ソフトウェア (図には示されていません) を備えたラップトップに接続されています。

液体窒素容器 (左)、中央チャンバー (白いボックス) の周りのピンセットコントロール (上) を備えた Linkam プランジャーレイアウト。 b 極低温チャンバー（左）、環境チャンバー（中央）とグロー放電器（右）、およびレンズ（下）を備えた中央チャンバー。 c 極低温チャンバーは、液体窒素コンテナーからの液体窒素で満たされており（aを参照）、極低温グリッド保管ボックスと液体エタンコンテナーが含まれています（補足ムービー1からのものですが、明確にするためにエタンガスチューブと真鍮のカバーは示されていません）。、中央の環境チャンバーには、サンプル容器用の 2 つの場所と 3 つのグリッド用の場所が含まれています。中央には温度制御された「ピンセットロック」があり、ピンセットを冷却しながら、吸引パイプ（図示せず）による水分の除去とレンズによる同時の目視検査のためにグリッドを所定の位置に置きます。 d 3 つのグリッドのグリッドボックス。 e サンプル容器とピンセット用のロックを備えた温度制御ブロック、および吸引チューブと光学顕微鏡用のグリッド位置決め用のスリット。

液体窒素デュワー (図 2a) には最大 200 ml の液体窒素が入っており、漏斗を通して充填し、窒素ガス流出用の開いた断熱チューブ (図 2 には存在しません) を備えた蓋で保護できます。デュワー内の液体窒素は温度センサーによって監視され、極低温チャンバー内のレベルは補充を制御するバルブによって一定に保たれます。

極低温チャンバー（図2b、c）には、輸送および保管用の3つのガラス化グリッドと液体エタン容器を保持できる特注の極低温グリッド保管ボックスを取り付けるための場所が含まれています。エタンバスおよび関連するガス充填チューブ (図示せず) は、エタンガスの自動凝縮を可能にするために温度制御されています。エタンの凍結を防ぐために、液体寒剤バスのレベルと温度は一定 (-183 °C) に維持されます。極低温チャンバーは比較的小さいため、気相の極低温を維持するために、極低温チャンバーの上部は冷却された銅板で遮蔽されています（図2b）。

環境チャンバー (図 2b、c) はペルチェ素子によって温度制御され、3 ～ 50 °C に設定できます。チャンバーの底には、蒸発によって湿気を生成するために数 mL の脱塩水を入れることができます。グリッドエリアには、取り外し可能なグリッドボックス（図2c、d）が含まれており、最大3つのEMグリッドを保管でき、グロー放電とその後のサンプルアプリケーションに取り出して使用できます。あるいは、液体中の EM グリッド上で接着増殖した細胞が入ったボックスが含まれています。環境チャンバーには、液体サンプル適用コンテナ用の 2 つの位置も含まれています。 LED 透過光モードと反射光モードを備えた ×10 レンズ一体型顕微鏡セットアップは、グリッドを保持しているピンセットをレンズの前の「ピンセットロック」に挿入している間に、湿度チャンバー内の EM グリッドを画像化できます。この温度制御された真鍮製の「ピンセットロック」(図 2e) にはスリットがあり、グリッドを備えたピンセットを中空円筒の中に入れることができます。ここでは、吸引と光学顕微鏡イメージングによるサンプルの同時除去のためにグリッドが配置されています。余分な液体を除去するために、最大 3 本の吸引チューブを備えた交換可能な吸引モジュールがグリッドの外側の縁に配置されています。「ピンセットロック」の温度はチャンバーの温度よりも低く設定されているため、ピンセットの先端とグリッドを露点付近に設定して水の蒸発を制御し、それによって水の層の厚さを制御し、同時にサンプル濃度の変化を防ぐことができます。。

グロー放電ユニットには、2 つの電極の間に配置されるグリッドの位置が 3 つあります。小型のオイルフリー真空ポンプを使用して、容積が 1 分以内に 1.8 × 10−1 mbar まで自動的に排気されます。グロー放電はプログラム可能な設定に従って自動的に実行され、通常は空気中で 5 mA で 2 分以内に実行されます。

Linkam プランジャーを使用する準備は、すべての電気ユニット (ペルチェ水冷クーラー、レンズヒーター、プランジャー、およびサポート PC) の電源を入れ、すべての消耗品 (エタンガスシリンダー、デュワー内の液体窒素、環境容器内の水) を接続または充填することによって行われます。チャンバー、極低温コンテナ内のグリッド保管ボックス、グリッドピックアップカートリッジへの EM グリッド、サンプルコンテナ内の液体サンプル)、プランジャーとカメラ制御ソフトウェアの起動、および液体エタン充填プロトコルの開始。詳細なプロトコルは補足ノート 1 に記載されています。

クライオグリッドの準備は、プログラムされたシーケンスの開始後に自動的に実行されます (補足ムービー 1)。まず、グリッドがピンセットで持ち上げられ、グロー放電ユニットに移送され、そこで放出され、空気プラズマ中で親水性にされます。次に、グロー放電したグリッドを再び取り上げ、サンプルの入った容器に移し、温度制御されたサンプル液に浸してサンプルをグリッドに塗布します。サンプル容器を満たすには少なくとも 10 µL が必要です。浸漬することにより、実際には 0.5 µL 未満がグリッドに適用されます。これは、手動アプリケーションで一般的に使用される 2 ～ 3 µL 未満です。グリッドの浸漬時間と液体コンテナからのグリッドの退避速度は両方ともプログラム可能です。続いて、ピンセットを使ってグリッドを温度制御された 10 倍の光学顕微鏡レンズの前に置きます。この構成では、ピンセットの先端とその中に保持されているグリッドの両方が温度制御されます。これは、ピンセットが、環境チャンバーの温度の露点より数度低く設定された温度制御された真鍮の「ピンセットロック」に触れているためです。次に、2 つまたは 3 つのチューブを含む吸引モジュールがグリッドの前に配置され、グリッドの縁に触れます。作動すると、調整および校正された流れで過剰な流体が吸引されます。同時に、グリッド上の水層の厚さを付属のカメラを備えた顕微鏡で視覚的に監視し、液体エタン容器への移送と突っ込みによるガラス化のタイミングは、リアルタイムのカメラ画像に基づいてオペレーターによってトリガーされます。ガラス化後、グリッドは極低温グリッド保管ボックスまたは CMS196V3 クライオステージでの極低温蛍光イメージング用のクライオカセットに移されます。

リアルタイム光学顕微鏡観察のためのグリッド上のビューを提供するために、ろ紙の代わりにチューブを使用して EM グリッドから余分な液体を除去しました (図 3 および 4、補足ムービー 3)。浸漬によるサンプルの適用後のグリッド上の「バルク液体」の光学顕微鏡観察では、水層の厚さの推定につながる特定の特徴は得られません（図3a）。水が薄くなると、グリッドの炭素側の空気と水の界面と炭素膜から発せられる光の干渉によって、色の付いた薄膜干渉パターンが現れ始めます（図3b）。流体をさらに除去すると、水面と炭素層の間の距離が約200 nm未満になると、これらの色の干渉縞は消えます（図3c）。さらに液体を除去した後、グリッドの側面にメニスカスのリザーバーが形成されると、十字のような光のパターンが表示されます（図3d）。その瞬間、正方形の中心に明るい円盤が現れます（図3e）。これは、中心の収量の水層の厚さがおよそ1ミクロン未満に減少するためです（ガラス化後に得られる電子の透過性から観察されるように）。側面では、より厚い水メニスカスがまだグリッドバーに付着しており、暗い縁に現れています（図3f）。さらに水を除去すると、この水も完全に除去される可能性がありますが (ここには示されていません)、私たちの経験では、グリッドの中心も乾燥します。クライオEM観察では、ガラス化後に後者の2つの「状態」のみが電子を透過するガラス化水層（図3eおよびf）を持ち、他の状態は電子の侵入深さを超え、クライオ内に黒い四角が生じることが示されました。 -EM画像。したがって、ガラス化の最適な瞬間は、光学顕微鏡で観察したときに、正方形の格子が明るい中央領域と暗い外側のリングを持つように見えるときです。実験では広い視野を得るために、主に×10の対物レンズを使用しました。ただし、×20 レンズを使用すると、開いた穴と水で覆われた穴の違いをより明確に観察できるようになり (Quantifoil 2/2 カーボンフォイルを使用)、厚さに関する知識を犠牲にして、ガラス化点をより正確に決定できるようになりました。グリッド上の水層の変化（補足図3C）。

リアルタイムLMおよびクライオEMによる膜厚評価。最初の 2 列: LM 観察 (グリッドの概要、グリッドの正方形)、3 番目の列: ガラス化後の同じ正方形のクライオ EM ビュー、最後の列: 1 つの正方形の概略側面図説明図、薄茶色のグリッドバー、灰色の炭素層液体表面は青い線で表示されます。 a 浸漬によるサンプルの適用直後、バルクサンプル溶液はグリッドの両側に存在し、光学顕微鏡では特定の特徴は観察できません。概略図は、液体表面 (青色の線)、グリッドバー (ベージュ)、およびグリッドの片側の炭素層 (灰色) を示しています。 b 水を除去した後、おそらく水の表面とグリッドのカーボン側のカーボン層の間の光の干渉により、色の付いた干渉リングが現れます。干渉線は 1 つの正方形内に表示される場合もありますが、複数の正方形にまたがる場合もあります。 c 干渉パターンが消え、グリッドの端付近では水層がグリッドバーと接触するため、外観がわずかに変化します。 d グリッド正方形の中心に明るいスポットが表示されます。これは、おそらく正方形内で水面が凹面の形状になっているためと考えられます。 e 再び、干渉リングが現れています。これは、他の水層と炭素層の間の干渉が原因です (補足ムービー 3 を参照)。明るいスポットは、数百ナノメートルよりも薄い水の層を表しています。クライオ EM 画像は、この四角形が電子を透過する中心領域を示しています。 LM 画像の端の暗い領域は、おそらく、光線がグリッドバーに向かって屈折し、グリッドバーによって吸収された結果であると考えられます。 ■fLM 画像では中央領域が拡大します。クライオ電子顕微鏡では、電子透過領域の拡大が見られ、エッジにはソフトエッジが現れています。 e と f のようなビューはガラス化の適切なタイミングであり、クライオ EM イメージングに使用可能なグリッド正方形が得られます。優れた単純な視覚的基準は、(e) に示すように、グリッド正方形の周囲の黒いフレームが最大領域を超えた後に再び後退することです。

a 液体サンプルを含む EM グリッドの LM 概要 (上、ガラス化前の最後のムービーフレーム)、および b ガラス化後のグリッドのクライオ EM 概要 (上)。 a および b の数字 1、2、および 3 は、異なるサンプル厚さの LM および EM での外観を示す同じグリッド正方形を示します。最適なサンプル厚さは、位置 2 付近で得られます。b、挿入図 3 では、サポートフィルム上のほとんどの穴が氷層で覆われておらず、b、挿入図 2 には、データ取得に使用できるサポートフィルムの穴がさらに多く含まれていることに注意してください。白丸は吸引チューブの位置を示す。

初期の実験では、グリッドの下側に配置された単一の吸引チューブを使用して流体を吸い取ると、水で満たされた四角形と乾燥した四角形の間に急峻な厚さの勾配が生じることが示されました。その結果、プロセス中のどの時点においても、データ収集に適した望ましい厚さを示す正方形は非常に限られた数だけでした。最適な厚さの正方形をより多く取得し、グリッド上でより適切に分布させるために、吸引チューブのいくつかのレイアウトをテストしました。グリッドの左側と右側に 2 つの吸引チューブを配置すると、最も再現性が高く、最良の結果が得られるようです (補足図 2)。製造されたグリッドの外観、品質、およびデータ収集の全体的な使いやすさ (図 4) は、Thermo Fisher Scientific Vitrobot または Leica EM GP を使用して研究室でガラス化されたグリッドと同等でした。

水の除去はグリッドの側面から行われますが、ピンセットの先端の（中央）位置では水がグリッド上に保持されることが多いため、厚さの勾配が作成され、これによりガラス化の適切なタイミングが可能になり、使用可能なグリッドの広い領域を生成できます。正方形。サンプル自体 (組成、粘度、表面張力) が、この勾配の挙動とグリッド上にどれだけの水が保持されるかに影響を与えると言わなければなりません。また、カーボン層のグリッドのタイプ（メッシュ、ベンダー、厚さ）と品質（しわ、裂け目、穴）、およびカーボンフィルムのタイプ（レースまたはクォンティフォイル：穴の量とサイズ）も、水の挙動に影響を与えます。吸引による薄層化中のグリッド。しかし、グリッドとサンプル間の個々の違いは、ガラス化グリッドの品質には影響しませんでした。準備中に、すべてのサンプルが個別に評価されます。

さらに、LM 観察により、グリッドの品質を評価するのに役立ついくつかの現象を観察することができました。まず、吸引による水分除去中に、グリッド上のタンパク質と小胞の凝集が観察できました。ミクロンサイズ範囲の凝集体は水面の局所的な厚さの変化を引き起こし、それが LM で観察できるコントラストの変化に変換されます。現在の設定では、ホイルの穴内のタンパク質の凝集は観察できませんでした。また、水端の不均一な後退により、カーボンフォイル上の疎水性パッチが時々観察されました（補足図3）。

突入前の光学画像内のグリッド正方形の目視検査は、クライオ EM による結果として得られるガラス化グリッドの品質と有用性を示す有用な指標ですが、炭素層の穴上の氷の膜の厚さが非常に重要です。 Quantifoil R2/2 EM グリッドの直径 2 マイクロメートルの穴は、×10 NA 0.25 レンズと 5 MP デジタルカメラを組み合わせて観察することができ、穴が水で覆われたままなのか、大きな表面によって開いたままなのかを調査できます。テンション。一般的な傾向としては、縁に水が溜まった四角形ではカーボン膜の穴が塞がれるというものでした。正方形の外側の縁に水がほとんどない場合、穴は水で覆われずに開いています。

大量の水の存在は吸引によって制御されますが、本質的に不安定な薄い水の層は環境の相対湿度の影響を受けやすくなります。この機器にはアクティブな湿度制御 (蒸発を減らすために環境湿度を高める) がないため、グリッドは約 79% (オランダでは通常) の可変湿度に囲まれています。したがって、「ピンセットロック」（図2c）を使用して、ピンセットの先端とグリッドを環境チャンバー内の設定温度より数度低く冷却し、グリッドを露点に維持し、蒸発を回避しました18。このようにして、グリッドからの水の蒸発を制御し、ガラス化に好ましい状態（図3eおよびf）を数分間維持することができました（補足図4および補足ムービー2）。

ガラス化装置の性能を検証するために、さまざまなサンプルと技術をテストしました。溶液濃度を調整すること以外はパラメータの最適化は行わず、すべてのサンプルは数回のガラス化セッション内で作成されました。クライオ EM 単粒子分析では、新たに精製したアポフェリチンをガラス化し、いくつかのグリッドを準備しました。グリッドの 1 つから数千枚の画像を記録し、X 線構造（PDB エントリ 6RJH）に適合できる 2.4 Å の再構成を決定しました（図 5a）。

a アポフェリチンの単一粒子分析結果 (n = 1)。データ収集による典型的なクライオEM画像（左）、解像度2.4Åでのアポフェリチンの3D再構成（中央）、EM密度におけるウマ脾臓アポフェリチン（黄色のPDB 6rjh）のX線構造の当てはめ（右）。 b DNA 折り紙キューブ上の Cryo-ET (n = 1)。穴のあるカーボンフォイルのいくつかの穴（左）と 1 つの穴内の粒子の分布（中央左）、DNA リボンの上部を示す断層像ボリュームのスライス（中央右）、および 3D 表面のクライオ EM ビュー12 個の DNA 折り紙キューブのレンダリング (右、個別に色分け)。 c 脂質小胞のクライオ EM (n = 5)。データ収集に通常使用される EM グリッドメッシュ正方形内の氷の厚さを示す Cryo-EM の概要 (左) と、カーボンフィルムの 1 つの穴内の小胞の分布の概要 (左中央)、断層像ボリュームのスライス多層小胞 (中央右) と個々の脂質層の 3D 表面レンダリング (右、着色された脂質層)。

Cryo-ET では、DNA 折り紙キューブをガラス化しました。これは、空気と水の界面で凝集して付着する傾向があるサンプルです。凝集は大幅には減少しませんでしたが、クライオ ET を実行することができました。断層撮影による再構成では、DNA が立方体のリボンとしてはっきりと示されました (図 5b)。リポソーム小胞の 2D クライオ EM イメージングを目的とした別の実験では、アムホテリシン B 小胞 (Ambisome®) がガラス化されました。これらのサンプルのクライオ EM 画像は、格子正方形内の覆われた穴の良好な分布を示し、多くの穴から良好な画像が得られました (図 5c 2 つの左パネル)。サンプルはまた、多層小胞上でクライオ ET で調製され、小胞の複数の膜層が明らかになりました (図 5c 2 つの右パネル)。

このガラス化デバイスは、タンパク質およびリポソーム懸濁液に適していることに加えて、細胞の調製も可能にします。これは、大腸菌細菌懸濁液と金EMグリッド上で接着増殖させた17個のクローン1マウス細胞の両方のガラス化およびクライオETイメージングによって証明されています（図6a、b）。最後に、Mitotracker で蛍光染色したこれらの真核細胞に対して、その後のクライオ LM イメージング (図 6c、左) と追加のクライオ EM (図 6c、中央、右) によってクライオ CLEM も実行しました。

細菌のクライオ電子顕微鏡検査。氷の厚さと細菌の分布を示す細菌サンプルの単一メッシュ正方形の典型的なクライオ EM 概要 (左) と、カーボンフィルムの 1 つの穴内の図 (右)。 b EM グリッド上で増殖させた単一メッシュ正方形の細胞の典型的なクライオ EM 概要 (左) と、典型的なリン酸塩に富む電子密度の高い封入体を含む内部小胞とミトコンドリアを示す細胞の薄い部分のクライオ EM 画像 (右) 。 c 細胞の Cryo-CLEM。蛍光タグを付けた細胞の暗視野画像（白）と蛍光画像（緑）を重ね合わせたファインダーグリッドの中央部分のクライオ光学顕微鏡画像の概要（左）、クライオ上にcryoLM蛍光画像を重ね合わせたもの-EM の概要 (白) (中央)、赤い四角形は高倍率で表示されたメッシュ正方形の位置を示します (右)。

クライオ EM サンプルを調製するためのこのガラス化装置を開発および構築するには、2 つの主な動機がありました。最初の目標は、ガラス化プロセスの一貫性を高め、ユーザーへの依存を減らし、制御を容易にすることでした。したがって、EM グリッドの取り出し (カスタムグリッドボックスからの取り出し、図 1d) から、完全に処理されたクライオ EM グリッドの保管 (および特殊なカセットでの CryoLM イメージング用) のための極低温容器に入れるまで、グリッドの取り扱い手順が自動化されました。）30．グロー放電とサンプル塗布を統合することにより、ユーザーによるグリッドとの対話が最小限に抑えられ、グリッドの劣化 (しわ) や損失が最小限に抑えられるという利点があります。使用の利便性を高めるために、極低温ガス (エタンまたはエタン/プロパン) の液化と極低温液体 (エタンおよび窒素) レベルの維持が完全に自動化されています。

2 番目の目標は、ガラス質水層の厚さをより再現可能なクライオ EM グリッドを準備し、準備中にサンプルの厚さとグリッド上の分布について直接フィードバックを得ることでした。クライオ電子顕微鏡イメージングを実行する前に、ガラス質の水層の厚さと、準備されたクライオサンプルの一般的な使用可能性について事前に知識があれば、クライオ電子顕微鏡での標本調製とグリッド品質チェックの時間のかかるサイクルを回避できます。水を除去する際に層の厚さの情報にアクセスするために、グリッド上の視界を妨げる濾紙の使用を控え、その代わりに、所定の位置に配置された複数のチューブを使用して、吸引を使用して余分な液体を除去することにしました。電子顕微鏡グリッドの外縁。従来の濾紙とは対照的に、吸引を使用すると、液体除去の速度と持続時間の両方を簡単に調整できます。これは、除去速度が濾紙の固有の特性であるためです。私たちの方法には、サンプルの化学的性質に対する濾紙の潜在的な影響を除去できるという追加の利点もあります18,31。液体吸引を使用する現在のセットアップの強力な利点は、グリッド周囲の反射および透過モード用のカメラと照明を備えた光学顕微鏡レンズの位置決めと、サンプルの除去中にグリッドの観察が可能になったことです。 ×20 レンズを使用した最初の実験では、2 ミクロンの穴を有効に表示できる約 45 正方形 (5 × 9 正方形、423 × 762 μm) の比較的広い視野が得られました。現在の推奨設定では、×10 レンズ (16 × 26 正方形、アップグレードされた 20 MP カメラでは 1.35 mm × 2.2 mm) を使用しており、個々の 2 ミクロンの穴の詳細度はそれほど高くありませんが、約 2 ミクロンの穴に相当する比較的大きなビューを提供します。 EM で観察できる総グリッド領域の 70%。

調製中に記録された光学顕微鏡検査と、得られたガラス化グリッドの極低温電子顕微鏡検査との比較により、極低温電子顕微鏡中のガラス化水の厚さを光学顕微鏡を使用して定性的に推定できることが実証された。光学顕微鏡画像から、クライオ EM で電子透過性のある領域を簡単に特定でき、カーボン内の水で満たされた穴と空の穴の違いさえも観察できました。最後の LM 観察からガラス化までの時間は最大 1 秒かかりますが、十分に速いため、多くの変化は現れません。結果として得られるガラス化水層の厚さは定量的に測定されませんでしたが、さまざまなサンプルの粒子サイズと断層撮影データに基づいて、結果として得られるガラス化水層は約 50 ～ 200 nm の間で変動すると推定されました。まとめると、薄膜干渉の光学顕微鏡観察により、ガラス化の適切な時点が適切に推定され、実際に使用可能なガラス化水層の厚さのグリッドが得られます。

白色光の薄層干渉により膜厚に関する詳細な情報が得られますが 32、透過光と反射光を使用する現在の設定では、正確な色を決定することはできません。また、約 100 nm 未満の薄膜は無色で強度のみが変化しますが、バックグラウンドの強度の差によってマスクされるため、特定の厚さに関連付けることはできません。ただし、50 ～ 200 nm の範囲での定量的な薄膜分析は、小粒子の高分解能クライオ EM に最適な厚さを決定するために重要であり、プランジャー設定にとって望ましい機能となります。適切なスペクトル分解検出および分析方法を使用すると、液体膜の定量的な厚さを光学的に決定できます。原理的には、3 つの波長の光 33 またはホログラフィーと干渉法 34 の組み合わせを使用した干渉色分析が、全視野光学薄膜測定に実証されました。ただし、厚さ 100 nm 未満のフィルムを測定するには、より短い波長が必要になる可能性があります。

2 つまたは 3 つのチューブを使用して吸引することで、大量の水をグリッドの縁から効率的に除去できます。これにより、グリッド上の水層の分布の厚さがわずかに変化し、グリッドの中心およびピンセットの先端近くの領域が厚く、グリッドの周縁近くの領域が薄くなりました。この氷の厚さの変化は望ましいものであり、すべてのグリッド上に最小数の使用可能な正方形が存在することが保証されます。吸引速度の最適化は可能ですが、私たちの場合、これは必要ありませんでした。

目視検査により、クライオ EM 用のグリッドの品質と使いやすさに関する事前知識が得られるため、良好なグリッドのみが TEM に転送され、データ収集に使用され、動作しない時折発生するグリッドを廃棄しながら、完全なグリッドの収量が得られます。プランジ前の支持フィルムの曲がりや破損などにより、薄くする際に十分な効果が得られません。精製タンパク質およびリポソームサンプルの場合、単一グリッド内の通常、正方形の 3 分の 1 (特に吸引チューブの位置の周囲) は乾燥しすぎてデータ収集に使用できませんが、3 分の 1 は使用可能です (ホイルの穴の大部分が覆われています)。ガラス質水を含む)、3 分の 1 にはほぼ同じ数の空のフォイル穴と満たされたフォイル穴があり、グリッドあたりの使用可能な正方形の数は 30% から 60% の間で変化します (n = 16)。細菌および付着細胞を含むグリッドの場合、水はこれらの構造の周囲によく保持され、乾燥の影響を受けにくいため、収量ははるかに優れていました。

クライオ EM を実行する前に、ガラス質の水の層の厚さ、グリッド上の使用可能な表面の分布と量について事前に知っておくことは重要ですが、データ収集に適切に動作する高品質で使用可能なグリッドを用意するための唯一の前提条件ではありません。。さらに、SPA データ収集の場合、優先配向、凝集、グリッド表面での濃度、およびタンパク質の破壊 35 に関するサンプルの品質は、グリッドを最適化するための重要なパラメーターですが、これらは光学顕微鏡による検出を回避しているようです。現在の光学顕微鏡のセットアップでは、タンパク質または小胞の広範な凝集がグリッド上で観察できるように見えましたが、これは水面の厚さの変化による可能性が最も高いと考えられます。これについてはこれ以上広範な研究はしませんでしたが、タンパク質の凝集を調査するための LM 手法が提案されており 36,37 、薄膜のサンプル調製中に追加の分光学的または蛍光 LM 手法を使用することは検討する価値があるかもしれないことを指摘しておきたいと思います。

最近開発された他の標本調製装置 29 とは対照的に、私たちはグリッド上のアプリケーションに使用されるサンプルの量を最小限に抑えることはしませんでした。代わりに、ここでは幅広い適用性を備えたデバイスを開発することを選択し、さまざまな異なるサンプルに対するその有用性を評価しました。アポフェリチンは、再構成の解像度を評価するための SPA ワークフロー標準として使用されました。 1 回のガラス化セッションを使用して、3 つのサンプルからなる 9 つのグリッドを準備することができました。そのうちの 1 つは、氷の厚さの最適化を行わずに、解像度 2.4 Å の 3D マップにつながる一晩のデータ収集に使用しました。また、クライオET用のDNA折り紙キューブサンプルも準備しました。このタイプのサンプルは、容易に凝集し、空気と水の表面に付着することが知られています。私たちの実験では、他のガラス化装置を使用した実験と比較して、非常に似た結果が得られました。同じセッションで、数種類のリポソーム上でクライオ EM 用のサンプルも調製しました。これにより、これらのサンプルは多大な労力や最適化を必要とせずに簡単に調製できることがわかりました。さらに重要なことは、粒子懸濁液に加えて、クライオ EM イメージングとクライオ CLEM イメージングの両方のために細菌細胞と細胞細胞も準備できることです。設計と自動化のレベルに大きな違いがあるにもかかわらず、調製されたサンプルとクライオ EM の結果はすべて、Leica EM GP および Thermo Fisher Scientific Vitrobot Mark IV を使用して調製された同じサンプルと区別できませんでした。

生物学的安全性の理由から、有害物質の放出を防ぐことが重要です。また、サンプル間の相互汚染を避けることも重要です。私たちは、ピンセットの先端を適切に洗浄したり吸引チューブを交換しないと、その後に生成されるグリッド間でサンプルが相互汚染される可能性があることに気付きました。洗浄と汚染除去は、交換可能なエレメントの使用、すすぎ、および高温オートクレーブ処理の手段を組み合わせることによって実現できます。サンプル浸漬容器とサンプルピックアップカートリッジは交換可能で、オートクレーブ滅菌または廃棄が可能で、すべてのシリコンチューブは使い捨てで簡単に交換できます。浸漬槽のラインナップは柔軟で、ピンセット先端のすすぎや洗浄のステップをソフトウェアで設定して自動化することができます。ピンセットアセンブリ、ステンレス吸引チューブ、および吸引プロセス中にサンプルのすぐ近くにある機械モジュールは、簡単に交換したり、取り外してオートクレーブ滅菌することができます。加湿チャンバーは、イソプロピルアルコール、アセトン、またはエタノールなどで洗い流すことができ、洗浄を容易にするために大きな半径を備えた設計になっています。この文書でテストしたプロトタイプの一部ではありませんでしたが、新しいバージョンでは、生物学的に活性な成分を不活化するために、HEPAフィルターと加熱された高温（約200℃）排気チャネルを追加してテストしました。

この論文で紹介されている装置は高度に自動化されており、準備中にユーザーの操作は、突入の望ましい瞬間を決定するためだけに必要となります。将来の開発には、ガラス化の最適な時点の自動検出が含まれます。ここで報告した実験結果は、層の厚さが減少するにつれて現れ、変化し、消える薄膜の干渉縞が、試料のガラス化後に得られる膜厚を直接的かつ明確に示すものであり、以下の方法で容易に判断できることを示しています。ユーザー。現在の設定では、いつプランジするかをユーザーが決定しますが、将来的には、この決定が従来型または AI ベースのマシンビジョンシステムを介して実装されることを想定しています。さらに、スペクトル分解された検出と分析により、液膜の定量的な厚さを光学的に決定できるため、ガラス化プロセスが完全にユーザーに依存しなくなりました。

ウマ脾臓アポフェリチンは、Sigma (9013-31-4) から購入し、150 mM NaCl 中で Superdex 200 Increase 3.2/300 カラム (Cytiva) でのゲル濾過によるガラス化の直前に精製しました。 25 mM トリス pH 7.5、2 mM DTT バッファー。ピーク画分を収集し、最終濃度 2.5 μM でのサンプル調製に使用しました。

ジミリストイルホスファチジルコリン (DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール (DMPG)、コレステロール、および DNP-cap-PE (44:5:50:1 mol%) を含むリポソームは、2019 年に Lubbers らによって以前に記載されているように調製されました。 38. 脂質 (Avanti Polar Lipids、アラバマ州、米国) をクロロホルム - メタノール (9:1 v/v) に溶解し、窒素ガス流下で一晩乾燥させました。リン酸緩衝食塩水（PBS）、pH 7.4、37℃で30分間、20 mMスルホローダミンB（S1402; Sigma Aldrich、米国ミズーリ州）で脂質フィルムを再水和することにより、最終脂質濃度0.8 mg/mlが得られました。。再水和した脂質混合物を 37 °C で 5 分間超音波処理してリポソームを形成し、プレパック NAP-25 カラム (17-0852-01; GE Healthcare、リトルチャルフォント、英国) を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製しました。リポソームを 5 μg/ml IgG1 DNP モノクローナル抗体と混合しました 39。

リポソームアンホテリシン B (Ambisome®) は、水で 10 倍に希釈した後、前述の製剤に使用されました 40,41。

DNA 折り紙立方体は、TALOS42 を使用し、エッジ長が 84 ヌクレオチドの標準立方体プリセットを使用して設計されました。 M13mp18 ssDNA (20 nM、Bayou Biolabs) と、20 mM MgCl2 を補充した適切な ssDNA ステープル (各ステープル 200 nM、Integrated DNA Technologies、補足データ 1 を参照) を総量 50 リットルで混合することにより、PCR チューブ内でフォールディングソリューションを作成しました。 μL。 DNA オリガミキューブは、Bio-Rad C1000 Touch™ サーマルサイクラーで次のプロトコルを使用して熱アニーリングされました: 80 °C から 76 °C まで 5 分/°C の速度で、75 °C から 30 °C までの速度で13.75 分/0.5 °C、29 °C から 20 °C まで 10 分/°C の速度で上昇。 10 個の 50 μL フォールディングソリューションを一緒にプールし、続いて Amicon® ウルトラ 0.5 mL 遠心フィルター (MWCO: 100 kDa) を使用して精製および濃縮しました。

17Clone1 マウス細胞を前述のように調製し 43、DMSO 中の 1 mM ストックから最終濃度 0.5 μM の MitoTracker™ (M7514、Invitrogen) で 1 時間蛍光標識しました。すべてのサンプルは、R2/2 カーボンフィルムを備えた Quantifoil 300 メッシュ銅グリッド上で調製されました。

グリッドを、Gatan K3 BioQuantum 直接電子検出器を備えた 300 kV で動作する Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) にロードしました。 50 フレームおよび累積線量 65 e/Å2 の動画は、EPU ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用して倍率 105,000 倍で計数モードで取得されました。これは、デフォーカス範囲が − の 0.836 Å/ピクセルの校正ピクセルサイズに相当します。 0.6～−2.5μm。オランダ電子ナノスコピーセンター (NeCEN) での 2 回の顕微鏡セッションで合計 2,348 のムービーが収集されました。詳細なデータ取得パラメータは、補足図 1 および補足表 1 にまとめられています。

すべての画像処理には RELION-3.1 ベータソフトウェア 44,45 を使用しました。簡単に説明すると、収集されたムービーは MotionCor246 を使用してビーム誘起ドリフト補正を受け、コントラスト伝達関数は CTFFIND-4.1.1847 によって推定されました。 RELION ガウスピッカーを使用して、689,633 個のパーティクルを自動的に選択しました。 2 ラウンドの 2D 分類の後、偽陽性と汚染特徴が破棄され、91,000 個の粒子データセットが得られました。 40Åにフィルタリングされた、以前に決定されたアポフェリチンマップが、3D精密化のための参照として使用されました。 91,000 個の粒子の最終セットは、光学収差およびビーム傾斜収差補正のための CTF 精密化、ならびに粒子ごとの焦点ぼけ、顕微鏡写真ごとの非点収差補正とそれに続くベイジアン研磨を受けました 45,48。次に 2 回目の 3D 精密化が実行され、2.4 Å のマップが得られました。マップ解像度は、ソフトエッジ溶媒マスクを掛けた 2 つの独立して調整されたハーフマップ間で計算された位相ランダム化補正された FSC 曲線の 0.143 基準で推定されました。最終的な再構成は、RELION 後処理で鮮明化され、局所的にフィルタリングされました。馬脾臓アポフェリチンの X 線モデル (PDB エントリ 6RJH49) は、EM マップのピクセルサイズを 0.836 Å/ピクセルから 0.82 Å/ピクセルに減少させた後、UCSF Chimera50 バージョン 1.13.1 内の「マップに適合」機能を使用して EM 密度に適合しました。より良いフィット感を実現します。マップは UCSF 1.13 と ChimeraX51 を使用して表示されました。

クライオ EM 画像は、Gatan 626 サイドエントリークライオホルダーを使用し、FEI Eagle 4k × 4k CCD カメラで 120 keV で動作する LaB6 源を備えた FEI Tecnai T12 Biotwin で記録されました。ガラス化前に記録された最新の LM 画像との相関関係を調べるために、グリッド全体をカバーする低倍率 (<×200) 画像を手動で記録しました。グリッド全体の合成画像概要と LM 画像とのオーバーレイは、Adobe Photoshop で作成されました。

Cryo-ET は、Gatan K3 BioQuantum 直接電子検出器を備えた 300 kV で動作する Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。一連の傾斜は、TOMO 4 ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用して、-56° ～ +56° の間で、0° から開始して 2° の傾斜ステップで、総線量 100 e/Å2 で、画像あたり 16 フレームで記録されました。公称倍率は 19.500 倍で、デフォーカスが -7 μm の校正済みピクセルサイズ 4.4 Å/ピクセルに相当します。クライオ電子断層撮影傾斜シリーズは、IMOD ソフトウェア 52,53 を使用して再構成されました。表面のレンダリングは、Amira ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用して手動で実行されました。

Cryo-LM は、Linkam CMS196M を搭載した Zeiss Axioimager M2 で実行されました。透明光画像と蛍光画像のスタック (75 µm ごとに 21 スライス) は、AxioCam MR R3 の EC PlanNeofluor ×10/0.30 Ph1 対物レンズを使用して、サンプルレベル 1 µm × 1 µm のピクセルサイズで記録しました。明視野画像は LED 光源を使用して記録し、蛍光画像は 38 HE フィルターセットを使用した HXP 120 V 光源を使用して記録しました。両方の画像スタックの最大強度投影は Zeiss ZEN 3.4 ソフトウェアを使用して作成され、オーバーレイは Adobe Photoshop 2021 で作成されました。Cryo-CLEM は、Gatan K3 BioQuantum 直接電子を備えた 200 keV で動作する Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。検出器。 MAPS ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用して相関付けを実行し、画像を記録しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成されたアポフェリチンクライオ EM マップは、アクセッションコード EMD-13738 で EMDB に寄託されています。ビデオ視覚化は、Adobe Premiere Pro、Maxon Cinema 4D、および Maxon Redshift を使用して作成され、補足ムービー 1 および 2 として利用できます。この研究を裏付けるデータは、要求に応じて対応著者から入手できます。

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サンプルの準備については、Meindert Lamers、Willem Noteborn、Leoni Abendstein、Georg Wolff (CCB、LUMC) に感謝します。この研究は、Instruct-ERIC センターであるライデン大学のオランダ電子ナノスコピーセンター (NeCEN) へのアクセスの恩恵を受けました。この研究における電子顕微鏡検査は、オランダ研究評議会 (NWO) の資金提供を受けている研究プログラム「大規模研究インフラのための国家ロードマップ (NEMI)」、プロジェクト番号 184.034.014 の一部です。

電子顕微鏡、細胞およびケミカルバイオロジー、ライデン大学医療センター、私書箱 9600、2300、RC、ライデン、オランダ

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RIK: 概念化、方法論、検証、調査、執筆 - 原案、視覚化、監督。 MvN: 概念化、方法論、検証、調査。 HV: 概念化、方法論、検証、調査。 PAG: ソフトウェア。 AJK: 執筆 - レビューと編集、資金調達。 AK: 概念化、方法論、監督、資金調達。 WJ: SPA データ収集。 LLRR: データ分析。 MS: 概念化、方法論、執筆 - レビューと編集、監修。

ローマン・I・コーニングへの書簡。

Linkam Scientific Instruments Ltd. は欧州特許 EP3018467 A1「顕微鏡サンプル調製」を取得しました (発明者 ACFK、MvN、HV、RIK、および MS)。 PAG は Linkam Scientific Instruments の従業員です。 ACFK は、英国の Linkam Scientific Instruments Ltd. の所有者です。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Radostin Danev と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Koning, RI、Vader, H.、van Nugteren, M. 他吸引とリアルタイムの光学検査を使用した、制御可能なサンプル厚さによるクライオ EM サンプルの自動ガラス化。 Nat Commun 13、2985 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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受信日: 2021 年 12 月 2 日

受理日: 2022 年 4 月 26 日

公開日: 2022 年 5 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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