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Nature Communications volume 14、記事番号: 1545 (2023) この記事を引用

1750 アクセス

21 オルトメトリック

メトリクスの詳細

SARS-CoV-2 の主要なプロテアーゼ (Mpro) は、ウイルス ポリタンパク質の切断を担当します。 Mpro の自己処理は成熟と呼ばれ、酵素の二量体化と活性にとって重要です。 ここでは、C145S Mpro を使用して、溶液中の N 末端切断の構造とダイナミクスを研究します。 ネイティブ質量分析分析では、混合オリゴマー状態が切断された粒子と切断されていない粒子で構成されていることが示され、N 末端のプロセシングが二量体化にとって重要ではないことが示されています。 3.5 Å のクライオ EM 構造により、結晶環境の制約の外側での Mpro N 末端切断の詳細が得られます。 我々は、異なるクラスの阻害剤がオリゴマー状態間のバランスを変えることを示します。 非共有結合性阻害剤 MAT-POS-e194df51-1 は二量体化を防止しますが、共有結合性阻害剤ニルマトレルビルは、N 末端が損なわれていない場合でも、単量体から二量体への変換を誘導します。 我々のデータは、Mpro 二量体化が、N 末端プロセシングではなく、基質プロセシング中の共有結合による誘導適合によって引き起こされることを示しています。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、COVID-191 の原因物質です。 SARS-CoV や中東呼吸器症候群コロナウイルス (MERS-CoV) と同様に、SARS-CoV-2 はベータコロナウイルスの属に属する一本鎖 RNA ウイルス (ssRNA) です1、2。 SARS-CoV-2 ゲノムは、約 30,000 個のヌクレオチドで構成されており、ORF1ab 遺伝子は、リボソーム フレームシフト後に 16 個の非構造タンパク質 (nsp) を 2 つのポリタンパク質としてコードする役割を担う大きなオープン リーディング フレーム (ORF) であり、1a と 1a と名付けられます。 1b1、2、3。 ウイルスポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングはウイルスのライフサイクルに不可欠であり、これは SARS-CoV-2 がコードする 2 つのシステインプロテアーゼによって行われます。nsp3 のドメインの 1 つであるパパイン様プロテアーゼ (PLpro) とウイルスの主要プロテアーゼです。 (Mpro または 3CLpro)、nsp54,5 によってエンコードされます。 PLpro はウイルスのポリタンパク質を 3 つの部位で切断しますが、Mpro は独自の N 末端および C 末端を含む 4,5 の 11 の異なる部位でポリタンパク質を切断します 6。 Mpro は、SARS-CoV-25 に対する薬剤開発の最も有望な標的の 1 つです7。 この標的に関して収集されたすべての構造および生化学情報は、米国、欧州、中国で緊急使用が承認された最近の薬剤パクスロビッド/ニルマトレルビル 10 を含む、新しい抗ウイルス薬 8、9、10、11 の迅速な開発にとって極めて重要です。

異種発現された成熟 Mpro を得るために、研究者らは、nsp4 の C 末端部分を nsp5 構築物の N 末端部分に付加し、インビトロでの Mpro の自己切断と二量体化を可能にする一般的な戦略を採用しました6。 以前、我々は、N末端にnsp4のC末端部分を含むSARS-CoV-2 Mpro C145S変異体の活性と生化学的プロファイルを説明した6。 このセリン変異により、活性はあるがはるかに遅いバージョンの Mpro が生成されました。これは、この酵素の生化学的側面を研究するための貴重なツールです。 二量体 Mpro とは異なり、このサンプルは溶液中でモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーの動的混合物として挙動しました6。 このセリン変異体の残存活性により、N 末端 nsp4-nsp5 ペプチドのゆっくりとした切断が可能となり、成熟プロセス中の溶液中の Mpro のオリゴマー状態を監視できるようになりました 6。 我々は、Mpro C145S の四量体が 2 日間にわたって、N 末端切断に正比例する現象で二量体としての平衡に達することを観察したため、N 末端プロセシングが二量体化にとって重要であると推測されました6。 さらに、我々は以前、四量体 Mpro サンプルから得られた nsp5-nsp6 C 末端ペプチドと複合体を形成した Mpro C145S の結晶構造を明らかにし、この重要な切断成熟イベントの詳細な描写を示しました。 要約すると、2 つの成熟 Mpro 二量体は二量体-二量体一時的複合体を形成し、1 つの Mpro 分子の C 末端を別の Mpro 分子の活性部位に向けて配置し、その後トランス切断イベントで C 末端プロセシングが起こります6。

今回我々は、nsp4-nsp5切断部分を含むSARS-CoV-2 Mpro C145S変異体の低温電子顕微鏡（cryo-EM）構造を解像度3.5Åで報告する。 この構造では、N 末端プロセシング中に 2 つの折り畳まれていない nsp5 プロトマーに結合した Mpro の溶液中の状態が垣間見えます。 我々は、二量体化は以前に想定されていたようにN末端プロセシングに依存せず、おそらく基質プロセシング中の共有結合に必要な誘導適合の結果であることを実証します。

SARS-CoV-2 Mpro C145S の多量体を含むピークのネイティブ質量分析により、以前に SEC-MALS 分析で示されたように、サンプルが単量体、二量体、三量体、四量体の混合物で構成されていることが明らかになりました 6。 さらに、我々は、折り畳まれたおよび折り畳まれていない未切断のnsp4-nsp5ペプチドの配列を含むモノマー粒子を観察した。 N末端ペプチドの切断が二量体化のトリガーとして機能する、我々の以前の成熟モデルと一致しています。

ピークは左から右に、切断されたモノマー (青い半円) と切断されていない (赤い半円)、切断された (青い円) または半分切断された (青 - 赤の円) 粒子によって形成された二量体、2 つの切断された粒子と 1 つの切断されていない粒子によって形成された三量体を示します ( 3 分の 2 が青、3 分の 1 が赤の円）、および 2 つの切断された粒子と 2 つの切断されていない粒子によって形成される四量体（4 分の 2 が青、4 分の 2 が赤）。 他の形式のマイナーピークについては補足資料に記載されています。 グラフは、個々のネイティブ質量分析実験からプロットされました。

しかし、ネイティブ質量分析法では、オリゴマー状態を含むピークが、非切断（理論質量 34,554.54 Da）および切断（理論質量 33,780.58 Da）の nsp4-nsp5 粒子の組み合わせによって形成される可能性があることも明らかになりました。 同じことが三量体または四量体の両方のピークにも当てはまり、驚くべきことに、切断されたペプチドと切断されていないペプチドのすべての組み合わせの可能性によって構成されている可能性があります（図1および補足図1）。 これは、N 末端処理が二量体化を決定するという Mpro 成熟の予備モデルと矛盾します 6、12、13。 また、オリゴマー状態の平衡は、より多くの切断要素が存在する状態に有利​​であることも質量相対量によって明らかであり（図1および補足図1）、N末端切断が二量体化に直接関与しているというモデルに依然として適合しています。 。

これらの結果を確認するために、異なる設定を使用してサンプル 2 の二次ネイティブ質量分析を実行しました。 Orbitrap Q-Exactive UHMR を使用して、7 つの電荷状態分布が観察されました。 補足図 6 で、Agilent 機器による前回の実行データと比較しました。m/z ~ 2500 付近で 11+ イオンを中心とする豊富な電荷状態分布は、分子量 34,556 ± 24 Da の Mpro に対応します (補足図の m1 .6）。 同様の大きさの電荷を持つ低豊富な電荷状態分布も観察され、これは質量33,865±44 Da（補足図6のm2）を持つ種に対応します。 これら 2 つの電荷状態分布は、異なる Mpro モノマーに割り当てることができます。 m/z 4000 ～ 5000 の間に複数のピーク系列が見られます (これらはすべて荷電状態 16 + に集中しています)。これらは、m1m1 ホモダイマーおよび m1m2 ヘテロダイマーと一致する分子量 (つまり、ホモダイマーの場合 67,687 ± 44 Da) を持つイオンに対応します。ヘテロダイマーの場合は 68,466 ± 9 Da。 興味深いことに、スペクトル内の追加のピークは、m1 と m2 の量が異なる高次のオリゴマー状態と一致する分子量にデコンボリューションする電荷状態に対応します。 それでも、データは、サンプル 2 が切断されたプロトマーと切断されていないプロトマーを組み合わせたネイティブ粒子で構成されていることを示しており、以前の観察を裏付けています。

ここでは、SARS-CoV-2 Mpro C145S の 3.5 Å における低温電磁構造を説明します (図 2)。 最終モデルでは、両方の鎖で C145S Mpro の 306 残基すべてが確認でき、さらに両方の活性部位を占有する少なくとも 11 残基長のペプチドの明らかな証拠が示されました (図 3a)。 最終モデルでは、回転異性体、Cβまたはラマチャンドランの外れ値は示されず、マップモデル相関係数（CC）は0.80でした（図3b、c）。 モデルおよび/またはマップは、コード 8EY2 (PDB の場合) および EMD-28666 (EMDB の場合) で寄託されました。 最終的なクライオEMモデルは、X線で既知の構造（図3d）に非常に似ており、Mproの成熟二量体形態（PDB 7KPH）と比較した場合のRMSDは0.7Å（3,909原子の場合）、または1.2Å（原子の場合）でした。 3,822原子）C145S変異体（PDB 7N5Z）のX線構造と比較した場合（図3dおよびe）。 データの収集と処理による統計とパラメータを表 1 に示します。

a 整列した顕微鏡写真。スケールバーは下部にあります。 b 得られた顕微鏡写真から計算されたCTF関数。 c 抽出された粒子の例。 d 最終再構成に必要な手順の詳細な概略図。取得された 2D クラスと 3D クラス、および最初の高解像度再構成が強調表示されています。 e 最終再構成の半分のマップ間のフーリエシェル相関 (FSC)。 上部のグラフは、x (青)、y (緑)、z (赤) の方向で計算された FSC と空間周波数の関係を示しています。 平均 cos 位相は黒色で、グローバル FSC は黄色でプロットされています。 下部には、角度ごとの FSC の割合 (青) とゴールドスタンダード FSC プロット (赤) が重ねられています。 f 2 つの方向から最終マップに投影されたローカル解像度。

表面として表示された最終マップの 4 面回転図。鎖 A と B はそれぞれ白と灰色で色付けされ、活性部位ペプチドマップはシアン色で色付けされています。 b チェーン A (青色) ドメイン III モデルを最終マップ (灰色) に適合させます。 c チェーン A (青) と B (サケ) の境界領域を最終的なクライオ EM マップ (灰色) に当てはめました。 d X 線 Mpro モデル (黄色、PDB 7KPH)、X 線 SARS-CoV-2 C145S Mpro (ピンク、PDB 7N5Z)、および SARS-CoV-2 C145S Mpro クライオ EM モデル (濃青色) の重ね合わせ。 e SARS-CoV-2 C145S Mpro クライオ EM モデル チェーン A (左) および (右) は、Mpro の RMSD 対 X 線モデルに従って色分けされています (PDB 7KPH)。

これまで、溶液中で観察された Mpro C145S の四量体サンプルは、二量体-二量体会合の結晶構造で得られたものと同じ組織を持っていると考えられていました6。 しかし、Mpro C145SのクライオEM構造は、切断前の瞬間にnsp4-nsp5領域に固定されたMproの二量体粒子を明らかにし、PおよびP'キー残基の詳細な密度を示しました（図3a）。 分解能 3.5 Å の構造は、Mpro 成熟の重要なステップである N 末端切断についての構造的洞察を提供し、二量体の鎖 A と鎖 B の両方におけるペプチドの明確な電子密度を示します (図 3a)。 活性部位 Ser145* 周囲の電位マップは、nsp4/nps5 ペプチド (nsp4 の SAVLQ 残基および nsp5 Mpro の残基 1 ～ 6、SGFRKM) の非共有結合的相互作用を示し、主に水素結合によって維持される拡張された β シートを形成します。 Thr24、Gly143、Ser145*、His163、Glu166、およびGln189で。 基質の位置は、生理学的ペプチド基質 (PDBid 7N6N および 7DVP) と複合体を形成した Mpro の結晶構造に非常によく似た結合位置を示し、30 ～ 54 原子間で計算された RMSD 値はそれぞれ 0.57 および 0.9 でした。

a nsp4-nsp5 ペプチド (黄色の棒) に結合した Mpro C145S チェーン A 表面 (灰色) の活性部位の図。 サブサイトは S4 から S5' で示されます。 b nsp4-nsp5 ペプチド (黄色の棒) に結合した Mpro C145S チェーン A 活性部位残基 (灰色) の詳細図。クライオ EM マップは表面 (等高線レベル 4.55) として示されています。 c nsp4-nsp5 ペプチドと Mpro C145S 鎖 A の間の相互作用スキーム。 d 選択されたローパス フィルター処理された粒子。切断されていないモノマー粒子 (赤色の線でマーク) に結合したダイマー粒子 (青色の線でマーク) を強調表示します。 スケールバーは左下に表示されます。 e 切断されていない粒子（赤）に結合したMpro C145S二量体（青）の概略図。

クライオ EM モデルでは、Gln0 が S1 サブサイトを占めており、その NE2 側鎖部分が水素結合 (鎖 A と鎖 B でそれぞれ 2.7 Å と 2.5 Å) を介して残基 Glu166 の OE1 原子と相互作用していることがわかります。 さらに、Ser145*のOG原子はGln0の主鎖水酸基と水素結合を形成します。 Gly143 主鎖アミドは P1' カルボニル酸素に水素結合を与え、触媒作用中にオキシアニオン ホールを安定化します。 S2サブサイトのLeu-1は、Leu-1主鎖アミドとGln189側鎖OE1の間に形成される水素結合を介してGln189と相互作用します（図4a、b）。 S2 サブサイトの Met49、Met149、および Gln189 は、捕捉された非結合型の酵素と比較して、より開いた立体構造をとります。 S3 サブサイトでは、Val-2 主鎖と Glu166 側鎖の極性原子の間に相互作用があります (図 4c)。 P4 の主鎖 Ala-3 の水酸基は、Gln189 の NE2 に水素結合を与えます。 タンパク質部位 S2 ～ S4 とタンパク質残基との間に極性相互作用が存在しないことは、これらの位置が対応しようとするさまざまな異なるアミノ酸の説明に役立つと考えられます。 活性部位に固定された Mpro 粒子の密度マップは、Mpro から残基 Met6 に向かってのみ広がっており、粒子の残りの部分はモデルの再構築には移動しすぎることが示唆されています。

最終的な再構成に使用されたローパスフィルター処理された粒子を注意深く検査することにより、二量体の活性部位領域のそれぞれの周囲に固定された細長いサテライト粒子があり、そのサイズと形状は部分的に折りたたまれたMproのモノマーと一致していることに気づきました（図4d）。 C末端切断中に形成される二量体-二量体複合体とは対照的に、これらの伸長したプロトマーは活性部位の周囲にランダムに分布しており、粒子が誤って折りたたまれていることを示しています（図4d、e）。 さらに、nsp5モノマーとして成形された細長い粒子は二量体を形成していないようです（図4e）。 これらの観察は、未成熟 Mpro の以前のモデルと一致しています。このモデルでは、N 末端に 3 つの非切断性アミノ酸が付加されると、Mpro の折り畳みが破壊され、二量体化が妨げられることが示されました 6。 それにもかかわらず、我々の構造は、溶液中での N 末端の切断中に捕らえられた Mpro の二量体形態のユニークな見解を明らかにしています。 衛星粒子を強調表示する 2D または 3D クラスを生成できませんでした。これは、部分的に折りたたまれた仮説と一致します。

多くのインシリコ分子シミュレーションとドッキング研究は、溶液の移動と基板認識における Mpro を説明しようと試みてきました 14,15 が、これらが結晶制約に囲​​まれていないことを検証するために利用できる実験的に決定されたモデルはありません。 ここでは、クライオ EM モデルを使用して、N 末端切断中の Mpro の動態を研究しました。 そのために、モデルの再構築に使用される粒子は、Mpro の溶液変動性を分類するために crioSPARC 3DVA ツールを使用して分析されました。 4 つの固有ベクトル コンポーネントのうちの最初のコンポーネントでは、生成された解釈できない低品質のボリュームが調査されました。 他の 3 つ (コンポーネント 2、3、および 4) は、粒子の変動性の分析に使用されるボリューム フレームを生成しました。 3 つすべてにおいて、両方の活性部位で nsp4 ペプチドに結合した Mpro の形状を持つボリュームが見られ、他のオリゴマー状態の粒子がデータ処理中にフィルターされたことを示唆しています。 予想通り、分析では、最も高い構造可塑性が Mpro の活性部位領域に集中し、最も高い RMSD がヘリックス 43 ～ 53 の領域と、β ヘアピン 19 ～ 27、62 ～ 65、および 166 に集中していることが示されました。 -171。 ヘリックス 43-53 には、Met49 など、疎水性サブサイト S2 の形成に関与する重要な残基が含まれています。 Met49 は Met165 とともに基質認識キャビティを形成し、ロイシンやバリンなどの疎水性側鎖を優先します6。 S1' サブサイトの形成に関与する β ヘアピン 19-27 も、タンパク質の残りの部分と比較すると、著しく可動性があるようです。

分析は、両方の活性サイトがフレーム上で徐々に拡大および収縮して​​いることを示しています（補足図2）。 Mpro 活性部位の拡大はすでに基質およびリガンド結合と相関している 6,16 ため、この変動は基質固定の異なる瞬間と相関している可能性があります。 基質とリガンドの結合中の Mpro 活性部位の立体構造の柔軟性は、極低温および室温の X 線結晶構造解析を使用して以前に観察されています 6,17。 ネラーら。 は、リガンド結合中に、P2-P5 サブサイトを形成する二次構造要素が、リガンド/基質の調節のために元の位置から最大 2.4 Å まで駆動され、サイトの形状と静電ポテンシャルをシフトさせることを実証しました 17。 活性部位の伸縮の動きは、両方の Mpro プロトマーで対称的であるようです (補足図 2)。 これは、Mpro プロトマーが独立して活性であることを実証した複数のインシリコ研究とは大きく異なります 18、19、20 が、完全な酵素効率にとって二量体化がなぜ重要であるかを説明するのに役立ちます。 溶液中のコロナウイルス Mpro の活性部位の可塑性は、酵素の動態を理解するために重要であり、特に実験データと相関しないことが多いタンパク質-リガンド相互作用のインシリコ解析に依存するプラットフォームにとって、創薬キャンペーンに役立つはずです 21。

C145S Mpro サンプルは、Mpro 6 の in vitro 挙動を調査するための貴重なツールであることが示されました。ここでは、酵素成熟に対する強力な阻害剤の影響を研究するための私たちの方法の能力を調査します。 私たちの最初の対象は、COVID Moonshot イニシアチブによって開発された、pIC50 7.5 の競合的非共有結合阻害剤 MAT-POS-e194df51-1 でした。 単量体 C145S Mpro (サンプル 1) または四量体 C145S Mpro (サンプル 2) を含むサンプルを 2 つの濃度の MAT-POS-e194df51-1 とインキュベートし、それらのオリゴマー状態を SEC-MALS によって 48 時間モニタリングし、比較しました。コントロール。 単純化のために、三量体は四量体プールの一部であるとみなされました。

０時間では、サンプル１対照は１．０／０．０（モノマー／ダイマー）比を示し、２４時間では０．８８／０．１２、４８時間では０．３９／０．６１に増加した（図５ａ）。 4:1 MAT-POS-e194df51-1/タンパク質を含むサンプル 1 に関しては、0 時間から 24 時間の間、単量体/二量体の比率は 1.0/0.0 のままでしたが、48 時間の時点までに 0.004/0.996 までしか増加しませんでした (図 1)。 5b)。 MAT-POS-e194df51-1/タンパク質のモル比を 4:1 から 0.4:1 に下げると、挙動がコントロールの挙動に近づき、24 時間で 0.89/0.11、24 時間で 0.74/0.25 の単量体/二量体比に達しました。 48時間。 サンプル 1 は、折り畳まれていないモノマーが基本的に時間の経過とともに完全に成熟したダイマーを形成していることを示しました。 MAT-POS-e194df51-1 をサンプル 1 に比較すると、どちらの濃度もダイマーの成熟を阻害し、折り畳まれていないモノマー粒子の蓄積を引き起こすようです。 この実験により、酵素サイクルに対する MAT-POS-e194df51-1 のこれまでに見られなかった独特の効果を実証することができ、基質と競合する能力だけでなく、酵素成熟サイクルをブロックして未切断のポリタンパク質を蓄積する能力も示しました。 2018年にConstantらは、デング熱プロテアーゼNS3に対して、最も効果的な阻害剤は、未切断のウイルスタンパク質前駆体を蓄積する切断部位を特異的に標的とする必要があることを実証した22。 この場合、この阻害された表現型が他の細胞内ウイルス表現型をトランスドミナントに阻害し、薬剤耐性変異体の生成を抑制する可能性があります。 SARS-CoV-2の代謝における非切断元素の影響を理解するには、さらなる研究が必要となるだろう。

a 0 時間 (上)、24 時間インキュベーション後 (中央)、および 48 時間後 (下) のモノマーを含む対照反応。 b 非共有結合阻害剤 MAT-POS-e194df51-1 の存在下での、0 時間 (上)、24 時間インキュベーション後 (中央)、および 48 時間後 (下) のモノマー変換反応。 c 共有結合阻害剤ニルマトレルビルの存在下での、0時間（上）、24時間インキュベーション後（中央）、および48時間後（下）のモノマー変換反応。

サンプル 2 の対照では、0 時間で検出されたタンパク質質量の比は 0.43/0.34/0.23 の単量体/二量体/四量体で、24 時間では 0.09/0.8​​9/0.02、48 時間では 0.0/0.98/0.02 に変化しました (図 2)。 6a)。 4:1 MAT-POS-e194df51-1/タンパク質を含むサンプル 2 では、0 時間で 0.49/0.45/0.05 のモノマー/ダイマー/テトラマータンパク質質量が検出され、24 時間では 0.49/0.51/0.0 に変化しました。 48時間で0.45/0.55/0.02(図6b)。 0.4:1 MAT-POS-e194df51-1/タンパク質を含むサンプル 2 では、0 時間で 0.46/0.47/0.06 のモノマー/0.47/0.06 のモノマー/ダイマー/テトラマータンパク質質量が検出され、24 時間では 0.26/0.73/0.0 に変化しました。 48時間で0.02/0.96/0.02。

a 0 時間 (上)、24 時間インキュベーション後 (中央)、および 48 時間後 (下) の四量体を含む対照反応。 b 非共有結合阻害剤 MAT-POS-e194df51-1 の存在下での 0 時間 (上)、24 時間インキュベーション後 (中央)、および 48 時間後 (下) の四量体変換反応。 c 共有結合阻害剤ニルマトレルビルの存在下での四量体変換反応、0 時間 (上)、24 時間インキュベーション後 (中央)、および 48 時間後 (下)。

この実験の対照では、サンプルが四量体、二量体、単量体の混合物として開始されることがわかりました。 48 時間経過すると、モノマーとテトラマーの両方が消失し、ダイマーが優勢になったことがわかります。 サンプル 2 における MAT-POS-e194df51-1 の存在は、サンプル 1 におけるモノマー消費の阻害と同じ効果を引き起こしているようですが、テトラマーの消費も加速しているようです。 四量体サンプルを酵素と基質の複合体であると考えると、競合阻害剤が Mpro 活性部位に結合している折り畳まれていない基質の転位を引き起こすため、競合阻害剤がサンプルにこの影響を与えるのは論理的です。 サンプル 1 と並行して、サンプル 2 のモノマーからダイマーへの変換も MAT-POS-e194df51-1 の存在によってブロックされ、この阻害剤が活性をブロックするだけでなく、成熟プロセスを妨げ、抗ウイルス効果を超えて増強する可能性があることが明らかになりました。ターゲットに対する威力。

ｐＩＣ５０が７．７１０である共有結合型Ｍｐｒｏ阻害剤ニルマトレルビル／ＰＦ－０７３２１３３２の効果も、Ｃ１４５Ｓサンプルに対して試験された。 この分子の効果は、MAT-POS-e194df51-1の効果とは著しく異なりました（図5c）。 4:1 ニルマトレルビル/タンパク質を含むサンプル 1 では、0 時間で検出された単量体/二量体タンパク質質量間の比 0.65/0.35 が、24 時間で 0.06/0.94、48 時間で 0.02/0.98 に変化することがわかりました (図 5c)。 。 ニルマトレルビル/タンパク質を 4:1 で含むサンプル 2 では、0 時間で検出されたモノマー/ダイマー/テトラマータンパク質質量間の比率は 0.31/0.56/0.12 でしたが、24 時間では 0.0/0.88/0.12、0.0/0.98/0.02 に変化しました。 48時間後（図6c）。

サンプル 1 では、ニルマトレルビルの存在により、ゼロ時間であってもモノマーからの二量体の形成が強力に誘導され、時間の経過とともに二量体形成の比率が大幅に向上し、24 時間後にはほぼ完全に変換されることがわかりました（図 5c）。 サンプル 2 では、モノマーとテトラマーの両方の平衡も、ダイマー形成を促進するためにずれているように見えます (図 6c)。 四量体の場合、消費量の増加はニルマトレルビルと基質酵素複合体間の競合によって簡単に説明できますが、単量体の二量体への変換率の加速は全く予想外でした。 しかし、これらのユニークな結果は、タンパク質成熟の最初のステップである N 末端プロセシングの詳細に光を当てる可能性があります。

このステップに関する我々の最初のモデルは、N末端切断はシスとトランスイベントの混合であり、その適切な切断により二量体化を妨げる立体障害が除去されるというものであった6。これは、以前に提案されたSARS-CoVモデルと一致していた。 Mプロ12、13。 しかし、共有結合阻害剤（非共有結合ではない）が非切断サンプルで二量体化を誘導する可能性があるという事実は、二量体化の引き金がN末端プロセシングではなく、共有結合自体によって引き起こされる誘導適合であることを示唆しています。 。 このモデルは、なぜオリゴマーが切断された粒子のみではなく、切断されていない粒子と切断された粒子の組み合わせによって形成されるのかも説明します（補足図1）。

この仮説を確認するために、ニルマトレルビルの存在下で Mpro C145S モノマーを結晶化しました。 結晶構造により、C145S 変異にもかかわらず、ニルマトレルビルがタンパク質に共有結合していることが明らかになりました。 それにもかかわらず、本発明者らは、隣接するドメインIIIからのMproヘリックスαF、αHおよびαIの置換も観察した。これは、切断されていないN末端アミノ酸による立体障害によって引き起こされると思われる(図7)。 これは、活性部位残基 Phe140、Glu166、Pro168、および Gln1896 の置換が見られないことを除いて、未成熟 Mpro の以前の構造と似ています。 これは、共有結合により活性部位の適切な再形成が可能になり、適切な N 末端切断が存在しない場合でも二量体化イベントが可能になることが示唆されました。 二量体化を防ぐためには、阻害剤が非共有結合性であり、ウイルスポリタンパク質の 11 個の異なる切断部位すべてに結合する Mpro の単量体形態をうまく阻害する必要があると推測されるかもしれません。

Ser1 および Gln-1 のアルファ炭素は赤い球として強調表示されます。 ネイティブ Mpro は灰色の透明な漫画として示され、Ser1 アルファ炭素は緑色の球として強調表示されます。

未切断ペプチドに結合した C145S 変異体のクライオ EM 構造を、C145S (PDB 7N6N) 鎖 A (Ser145 に共有結合した切断ペプチド) および鎖 B (切断後ペプチド) の以前の X 線構造と組み合わせると、酵素処理のすべての段階で Mpro の構造変化を垣間見ることができます (図 8)。 これらの構造は、酵素プロセスがアポ構造と同様の位置にある重要なアミノ酸から始まることを明らかにしています（図8a）が、基質ペプチドP3〜P5を収容するにはループβ166〜171が酵素コアに向かって押し出されなければなりません（図8a）。 8b)。 次に、酵素と基質の共有結合の仲介中に、このループ β166-171 を酵素コアのさらに奥まで押し込んで、C/S145 と切断結合カルボニル C の間の共有結合距離を短くし、活性部位に適切に固定できるようにする必要があります。 43～53および62～65は緩んだ構造を示しています（図8c）。 切断後、生成ペプチドは C/S145 に結合されなくなり、活性部位ドメインがそのアポ構造に戻ることが可能になります (図 8d)。 このプロセス中に、Mpro 活性部位表面は、すべての酵素と基質の中間構造に適応するために、重要な構造的および静電ポテンシャルの修飾を受けます。これについては、この一連の構造で詳しく説明します (図 8)。

a アポ型の Mpro の主要な活性部位残基 (緑色の棒) (上)、黄色で示したアポ状態の活性部位の漫画図 (中)、および Mpro 活性部位の表面に投影された計算された静電ポテンシャル (下)。 b 無傷のペプチドに結合した Mpro C145S の主要な活性部位残基 (緑色の棒) (上)、それぞれのフォームからの活性部位の漫画図 (中央)、およびそれぞれのフォームから投影された計算された静電ポテンシャル (下)。 c 酵素-基質中間複合体を形成する切断されたペプチドに共有結合したMpro C145Sの主要な活性部位残基（緑色の棒）（上）、それぞれの形態からの活性部位の漫画図（中）、およびそれぞれの形態から投影された計算された静電ポテンシャル（下） ）。 d 切断後ペプチドと複合体を形成した Mpro C145S の主要な活性部位残基 (緑色の棒) (上)、それぞれの形態からの活性部位の漫画図 (中)、およびそれぞれの形態の投影された計算された静電ポテンシャル (下)。 上図と中央図の透明な棒と漫画 (灰色) は、前のステップの相対要素からの構造位置を表します。

SARS-CoV-2 Mpro は、3 つのドメインからなる 34 kDa タンパク質であり、本質的に二量体として活性です 5,6。 SARS-CoV-2 Mpro の最初の X 線構造が、2020 年 2 月にコード 6LU7 でタンパク質データ バンク (PDB) に寄託されて以来 23、PDB では、最大 1.2 Å までの Mpro からの最新構造が 450 近く利用可能になっています。解像度 (PDB 7K3T) が高く、Mpro は構造的に最もよく特徴付けられた SARS-CoV-2 nsp の 1 つとなっています 33。 Mpro は、複数の新薬候補 5、24、25、26、27 および再利用分子 24、28、29、大規模フラグメント スクリーニング キャンペーンからのフラグメント 30、および内因性ペプチド 6、16、31 およびペプチドと複合した X 線によって特徴付けられました。 -模倣薬候補32. さらに、室温および極低温の X 線構造と中性子の結晶構造解析を使用して、Mpro の作用機構 16,33 および基質とリガンドの認識時の立体構造変化 6,17 を詳しく説明するための貴重な情報を提供することに成功しました。 しかし、ここで報告された Mpro の低温 EM 構造は、酵素と基質の認識および溶液中ダイナミクスの独特の特徴を明らかにしています。

また、Mpro N 末端切断はタンパク質の適切なフォールディングには重要ですが、二量体化には重要ではないことも示しました。 我々のデータは、二量体化イベントが、切断中の共有結合の形成中に誘導されるタンパク質の適合によって支配されることを示唆しています。 これは、N 末端の状態に関係なく、ウイルスの 11 個の Mpro 標的部位のいずれかの切断が二量体化のトリガーとして機能することを意味している可能性があります。 これらの観察は、2 つのプロトマー間の N 末端と C 末端のシス切断が必然的に成熟プロセスの最初のステップであるという以前に提案されたモデルとは異なります 13,34。 実際、以前の研究では、N 末端と C 末端が他のタンパク質に結合しているウイルス ポリタンパク質の in vitro モデルで基質誘導性二量体化が起こり得ることが示されていました 35。 私たちのモデルは、著者がN末端でトロンビンを使用することを選択したMERS-CoV Mproのケースなど、本物のN末端を生成するタンパク質生産に他の戦略を使用したMpro研究の理由も説明する可能性があります（したがって、タンパク質の生成を許可しません）興味深いことに、著者らは、MERS-CoV Mpro の二量体化が基質によって引き起こされる可能性があることも報告しており、これは私たちが提案するモードとも一致します 36。 それでも、初期の Mpro が処理されて成熟した Mpro に変換されると結論付けるには、より多くのデータが必要です。このプロセスが処理イベント、処理された粒子、またはその両方の組み合わせに依存している場合は、より多くのデータが必要です。 これらの観察は、コロナウイルス Mpro の成熟プロセス、および共有結合性阻害剤と非共有結合性阻害剤の薬力学の違いについての我々の理解に影響を与えます。

構築計画、クローニング、およびタンパク質発現の詳細は、別の場所に記載されています6。 簡単に説明すると、Edison Durigon 博士 (ブラジル、サンパウロ、サンパウロ大学) のご厚意により提供されたウイルス cDNA テンプレート (GenBank MT126808.1) を使用して、Mpro のコード領域 (残基 3264 ～ 3569) をクローニングしました。プライマーを使用: Fw 5' CAGGGCGCCATGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' および Rv 5' GACCCGACGCGGTTATTGGAAAGTAACACCTGAGAC 3'。 この配列は、LIC 法 37 を使用して pET_M11 ベクターに挿入されました。 次いで、このプラスミドを、プライマー：Ｆｗ：５’ＧＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣ３’およびＲｖ：５’ＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＡ３’を使用するインバースＰＣＲによって、Ｍｐｒｏ天然Ｎ末端残基（ＧＡＭＳＡＶＬＱ↓ＳＧＦＲＫ）を挿入するためのテンプレートとして使用した。 次に、プライマーFw 5' CCTTAATGGTTCATCTGGTAGTG 3'およびRv 5' AATGAACCCTTAATAGTGAAATTGG 3'を使用する逆PCRによってこのプラスミドにC145S変異を挿入し、pET_M11-C145S-Mproを得た。 この構築物には、N 末端 6x ヒスチジン タグとそれに続く TEV 切断部位、および nsp4 C 末端認識配列アミノ酸 (Ser-4、Ala-3、Val-2、Leu-1、Gln-0 ↓ ) が含まれています。 C145S置換を含むMpro配列による6。

タンパク質生産では、pET_M11-C145S-Mpro を使用して大腸菌 BL21 細胞を形質転換し、ZYM-5052 培地 38 で 37 ℃、200 RPM で OD600 が 0.8 になるまで培養し、その後 18 ℃、200 RPM で 16 時間発現させました。 。 細胞を4℃、5000 gで40分間遠心分離することによって回収し、溶解緩衝液（20 mM Tris pH 7.8、150 mM NaCl、1 mM DTT）に再懸濁し、超音波処理によって破壊しました。 可溶性タンパク質を含むライセートを、4℃、12,00x gで30分間の遠心分離によって清澄化しました。

C145S Mpro は、5 mL HisTrap FF カラム (GE Healthcare) を使用した固定化金属クロマトグラフィー (IMAC) によって精製されました。 緩衝液Ａ（２０ｍＭ トリス ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾール）でカラムを洗浄した後、２５０ｍＭ イミダゾールを補充した緩衝液Ａでタンパク質を溶出した。 バッファー A で平衡化した 5 mL HiTrap 脱塩カラム (GE Healthcare) を使用してサンプルをバッファー交換しました。6xHis タグを除去するために、2 mg の TEV プロテアーゼと 4 mM DTT をサンプルに添加し、4 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、切断されていないタンパク質と TEV をバッファー A での IMAC の第 2 ステップによって除去しました。次に、タンパク質を、ゲルで平衡化した HiLoad 16/60 Superdex 75 カラム (GE Healthcare) を使用したサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって精製しました。濾過緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）。 このサンプルの SEC プロファイルは、前述のように、Mpro の混合オリゴマー状態の複数の重複ピークを示しました6。 保持時間の長いピークは主に構成されており (サンプル 1)、保持時間の短いピークは主に四量体で構成されています (サンプル 2)。 タンパク質純度は SDS-PAGE で分析し、理論吸光係数 32,890 M-1.cm-1 39 を使用して定量しました。両方のピークの新鮮な精製画分を 10 mg.mL-1 で分注し、すぐに液体窒素中で急速冷凍しました。

グリッドの調製のために、SEC ピークの四量体 (サンプル 2) から新たに精製した C145S Mpro サンプルを氷中で解凍し、遠心分離し、ゲル濾過緩衝液で希釈しました。 次に、0.25 mg.ml-1 のサンプル 3 μL をグロー放電 Quantifoil 300 メッシュ Cu R2/2 グリッドに適用しました。 Vitrobot (FEI) を使用して、湿度 100%、4 °C でブロット力 1 で 2.5 秒間グリッドをブロットし、その後液体エタンに浸漬して凍結させました。

データは、試料レベルでの0.653Åの校正ピクセルサイズに対応する公称倍率130kxでスリット幅20eVのカウント超解像モードのK3検出器を使用し、300kVで動作させたTitan Kriosで収集されました。 動画は線量率 18.5 e-/px/s で 1 秒にわたって記録され、43 フレームに分割されました。 データ収集は、ThermoFisher Scientific EPU 2.12 を使用し、デフォーカス範囲が -0.5 ～ -2.5 μm で行われました。

高解像度の構造決定のために、Titan で収集された 13,770 本の超解像度ムービーは、RELION v3.141 に実装されている MotionCor240,41 を使用して線量重み付け、位置合わせ、2 回のビニングが行われ、物理ピクセルは 0.653 Å になりました。 得られた顕微鏡写真のコントラスト伝達関数 (CTF) は、CTFFIND-v4.142 を使用して推定されました。

SPHIRE-crYOLO43 を使用して 1,956,496 個の粒子が選択され、3 倍にダウンサンプリングされ、72 ピクセルのボックス サイズで抽出されました。 粒子は濾過され、3 ラウンドの 2D 分類で分類されました。 De novo 3D モデルには 569,725 個の良好な粒子が選択されました。 粒子は最大解像度で再抽出されました。 粒子はさらにフィルタリングされ、3D 分類で分類されました。 Relion v3.144 での 3D リファインメントとベイジアン ポリシングのために、最高の 3D クラスのパーティクルが選択されました。

次に、Refine3D ボリュームと 227,534 個の光沢のあるパーティクルが、リファインメントのために crioSPARC v3.2.0 にインポートされました45。 堆積された構造については、マップは最初に、余分な最終パス 1 つ、7 Å の初期ローパス分解能、および C2 適用対称性を備えた均質リファインメント アルゴリズムを使用してリファインされ、その結果、3.75 Å46 のゴールドスタンダード フーリエ シェル相関 (gsFSC) を備えたリファインされたマップが得られました。 結果として得られたマップは、1 つの余分な最終パス、8 Å の初期ローパス解像度、C2 適用された対称性、粒子ごとのデフォーカス最適化、およびグループごとの CTF 最適化を備えた不均一リファインメント 47 に使用され、3.6 Å の gsFSC を使用したリファインメント マップが得られました。 結果として得られたマップは、C2 に対称性を課したローカル リファインメント アルゴリズムを使用してリファインされ、gsFSC が 3.5 Å のマップが得られました。 同じプロトコルを C1 対称性でもテストしたところ、3.76 Å の gsFSC とほぼ同一のマップが得られました。 したがって、C2 マップはさらなるモデリングと改良に使用されました。 マップ解像度は、cryoSPARC Local Resolution と 3DFSC Processing Server48 を使用して計算されました。 C2 のデータ収集、処理、モデル改良の統計を表 1 に示します。データ処理ステップの概略図を図 2 に示します。

マップへのモデルの最初のドッキングは、PDB 7N6N を使用して実行され、UCSF ChimeraX v1.2.549 を使用して crioSPARC から鮮明化されたマップが実行されました。 高解像度マップの鮮明化と視覚化の強化には、phenix auto-sharpen50 を使用しました。 モデルの構築と改良は Phenix Real Space Refinement51 および Coot52 で行われ、検証は MolProbity53 で行われました。 図は PyMOL および ChimeraX v1.2.5 を使用して作成されました。 モデル改良の統計を表 1 に示します。

SARS-CoV-2 Mpro C145S 粒子の変動性を分析するために、cryoSPARC v3.2.054 で利用可能な 3D Variability Analysis (3DVA) ツールを使用しました。 そのために、(Relion で) クライオ EM データ処理 3D 分類中に使用された 569,725 個のフルサイズ粒子が、cryoSPARC v3.2.0 にインポートされました。 これらの粒子と Refine3D ボリュームは、対称性のない均一なリファインメント サイクルに組み込まれました。 次に、粒子とマスクを使用して、3DVA54 を使用してデータ分布の共分散行列の 4 つの固有ベクトルを計算し、分解能は 5 Å でフィルタリングされました。 モデル シリーズは 3DVA 表示ツールを使用して生成されました。 画像は ChimeraX v1.2.5 で生成されました。

逆相クロマトグラフィーは、Agilent 1100 HPLC システム (Agilent Technologies inc. – 米国カリフォルニア州パロアルト) を使用して質量分析の前にインラインで実行されました。 四量体ピークを含む新たに調製した C145S の 1 サンプル (サンプル 2) を 0.1% ギ酸で 20 μg/ml に希釈し、50 μl をチャンバー内に収容された 2.1 mm × 12.5 mm Zorbax 5 μm 300SB-C3 ガード カラムに注入しました。カラムオーブンを40℃に設定。 使用した溶媒系は、LC-MS グレードの水中の 0.1% ギ酸 (Millipore、溶媒 A) およびメタノール中の 0.1% ギ酸 (LC-MS グレード、Chromasolve、溶媒 B) から構成されていました。 クロマトグラフィーは以下のように実施した：初期条件は９０％Ａおよび１０％Ｂ、および流速１．０ｍｌ／分であった。 10% B で 15 秒後、10% B から 80% B までの 2 段階の直線勾配を 45 秒かけて適用し、次に 80% B から 95% B まで 3 秒かけて適用しました。 次いで、溶出を９５％Ｂで１分１２秒間均一濃度で進行させ、その後さらに４５秒間初期条件で平衡化した。 タンパク質の無傷質量は、MSD-ToF エレクトロスプレー イオン化直交飛行時間型質量分析計 (Agilent Technologies Inc. – 米国カリフォルニア州パロアルト) を使用して測定しました。 この機器は標準 ESI 源を使用して構成され、陽イオン モードで動作しました。 イオン源は、キャピラリー電圧 4000 V、ネブライザー圧力 60 psig、乾燥ガス 350℃、乾燥ガス流量 12 L/min で動作させました。 機器のイオン光学電圧は次のとおりです: フラグメンター 250 V、スキマー 60 V、およびオクトポール RF 250 V。

ネイティブ質量分析では、新たに調製したサンプル 2 の 1 つのサンプルを氷上に保持し、メーカーの指示に従って BioGel P6 (Biorad) スピンカラムを使用する 3 ラウンドのゲル濾過により、緩衝液を 75 μl の 50 mM 酢酸アンモニウム pH 7.5 に交換しました。 質量スペクトルは、標準 ESI 源を使用し、陽イオン 1 GHz モードで動作する Agilent 6530 QTOF を使用して取得しました。 サンプルはシリンジポンプを介して流速6μl/分で導入されました。 イオン源は、キャピラリー電圧 3500 V、ネブライザー圧力 17 psig、乾燥ガス 325℃、乾燥ガス流量 5 L/min で動作させました。 機器のイオン光学電圧は次のとおりでした: フラグメンター 430 V、スキマー 65 V、およびオクトポール RF 750 V。これと同じ設定を使用して、観察された折り畳まれた質量を持つ大腸菌 LacZ の四量体ネイティブ型 (理論質量 465,932 Da) を記述しました。四量体については 466,092 Da 55。

溶液中での精製サンプルのオリゴマー状態は、多角度光散乱 (SEC-MALS) と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーによって評価されました。 前述のように、すべてのアッセイは、20 mM Tris-HCl pH 7.8、100 mM NaCl、および 1 mM DTT で構成されるランニングバッファーで実行されました6。 そのために、濃度 50 μM の各 Mpro C145S オリゴマー 50 μL の 1 つのサンプルを、UV 検出器、miniDAWN TREOS 多角光散乱装置 (Wyatt Technology) とインラインで接続された Waters 600 HPLC システム (Waters) に注入しました。 ）、流量０．５ｍＬ／分のカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および屈折率検出器Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。 光散乱検出器はウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）を用いて正規化した。 データは、Wyatt が提供する ASTRA 7 統合ソフトウェアを使用して収集および分析されました。

分析したサンプルには 100 μg の C145S Mpro モノマーまたはテトラマーが含まれており、これらを 1% DMSO (コントロール) またはリガンドとともに 0 時間、24 時間、または 48 時間インキュベートしました。 Moonshot COVID Consortium から入手した非共有結合性阻害剤 MAT-POS-e194df51-1 を、阻害剤:タンパク質比の濃度 4:1 および 0.4:1 でテストし、それぞれ 0 時間、24 時間、または 48 時間インキュベートしました。サンプル。 共有結合阻害剤ニルマトレルビルは、阻害剤:タンパク質比濃度 4:1 でテストされ、0 時間、24 時間、または 48 時間インキュベートされました。 メソッドの分解能が十分でないことを考慮して、三量体と四量体のピークを合計し、四量体として処理しました。 生成されたすべてのデータは補足図 3 で入手できます。

5 mg/mL の C145S Mpro のモノマーサンプル (サンプル 1) を、タンパク質:化合物比 1:5 のニルマトレルビルとともに室温で 1 時間インキュベートしました。 次に、シッティングドロップ結晶化プレートを、0.1 M MES pH 6.7、5% DMSO、8% PEG 4000、20℃の条件で使用して設定しました。 結晶は 30% PEG 400 で凍結保護され、データは MANACA ビームライン (SIRIUS) で収集されました。 データは Autoproc56、57 経由で XDS で処理されました。 データは CCP458 経由で Aimless を使用してスケーリングされ、PDB 7MBG をテンプレートとして使用して Phaser59 で分子置換が実行されました。 データ収集統計を表 2 に示します。データは Coot でモデル化され、Acedrg および Refmac52、60、61、62、63 で洗練されました。 図は、ChimeraX、Pymol、BioRender.com を使用して作成されました。 この構造の電子密度は補足図7に示されています。

異なる設定を使用した確認実験として、前述のように Orbitrap Q-Exactive UHMR を使用してネイティブ質量分析を実行しました 64。 簡単に言うと、分析物溶液を、Zebaマイクロスピン脱塩カラム(7kDa MWCO、Pierce)を使用して200mM酢酸アンモニウムpH7.4(Sigma Aldrich)に緩衝液交換した。 1 ～ 3 µL の分析物 (200 mM 酢酸アンモニウム中) を含む 1 つのサンプルを、社内で準備した金コーティングされたガラス キャピラリーにロードし、約 1 µm の点まで引き上げました。 キャピラリーには、加熱された金属キャピラリー (100 °C) に対して 1.0 ～ 1.2 kV のバイアスがかけられ、ナノエレクトロスプレー イオン化によって陽イオンが生成されました。 質量分析計は、メーカーが推奨する「低 m/z」検出設定を使用して陽イオン モードで動作させました。 以下のパラメータは手動で調整されました。 ソース内トラップ電位: 20 – 50 V、4 ms。 HCD電位: 1 – 10 V; 圧力設定: 8.5。 ネイティブ質量スペクトルは、QualBrowser (Thermo Fisher Scientific) および OriginPro 2021 (OriginLab Corporation、ノーサンプトン、マサチューセッツ州) で視覚化されました。 ここでの M/z スペクトルとネイティブ ESI-TOF からの M/z スペクトルは、Mashunter B.07.00 (Agilent) を使用して分析しました。 ESIprot65 とイオンテーブルを使用します。 充電状態は手動で割り当てられました。 この実行の結果は、補足図 6 に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究に関連するすべてのデータは公開されています。 最終構造決定に使用されたすべての収集されたムービーと研磨粒子は、電子顕微鏡パブリック画像アーカイブ (EMPIAR) でコード EMPIAR-10810 で入手できます。 クライオ EM マップと構造モデルは、タンパク質データ バンク (PDB) のコード 8EY2 および電子顕微鏡データ バンク (EMDB) のコード EMD-28666 で入手できます。X 線モデルは、PDB コード 8EYJ で入手できます。 この研究で使用された構造は、コード 7N5Z、7KPH、7N6N、7K3T、および 7DVP で PDB データベースで入手できます。 このペーパーには、すべての SEC-MALS およびネイティブ質量分析用のソース データ ファイルが付属しています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

ウー、F.ら。 中国における人間の呼吸器疾患に関連する新型コロナウイルス。 ネイチャー 579、265–269 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. 中国の肺炎患者からの新型コロナウイルス、2019年。N. Engl. J.Med. 382、727–733 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

PR バットら。 SARS-CoV-2 RNA ゲノムの翻訳中のリボソームフレームシフトの構造基盤。 サイエンス 372、1306–1313 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オシピウク、J. et al. SARS-CoV-2 由来のパパイン様プロテアーゼとその非共有結合性阻害剤との複合体の構造。 ナット。 共通。 12、1–9 (2021)。

記事 Google Scholar

Zhang、L.ら。 SARS-CoV-2 の主要プロテアーゼの結晶構造は、改良されたα-ケトアミド阻害剤の設計の基礎を提供します。 サイエンス 368、409–412 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ノスケ、GD et al. SARS-CoV-2 の主要なプロテアーゼ成熟プロセスの結晶学的スナップショット。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 433、167118 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゴードン、DE et al. SARS-CoV-2タンパク質相互作用マップは、薬物再利用の標的を明らかにする。 ネイチャー 583、459–468 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chodera, J.、Lee, AA、London, N.、von Delft, F. パンデミック向けのクラウドソーシング創薬。 ナット。 化学。 12, 581 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フォン・デルフト、F.ら。 オープンな COVID 創薬の困難な取り組み。 ネイチャー 594、330–332 (2021)。

記事 ADS Google Scholar

オーウェン、DR 他 COVID-19 治療のための経口 SARS-CoV-2 Mpro 阻害剤の臨床候補。 サイエンス 374、1586–1593 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

新型コロナウイルスムーンショットコンソーシアムほか経口非共有結合性 SARS-CoV-2 の主要なプロテアーゼ阻害剤治療法のオープン サイエンス発見。 プレプリントは https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.29.339317v3 (2021) にあります。

Xia, B. & Kang, X. SARS-CoV 主要プロテアーゼの活性化と成熟。 Protein Cell 2、282–290 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スー、MF 他。 SARS-CoV 3CL プロテアーゼの成熟プロセスのメカニズム。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 280、31257–31266 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Römer、RA、Römer、NS & Wallis、AK SARS-CoV-2 関連タンパク質構造の柔軟性と可動性。 科学。 議員第 11 号、1–13 (2021)。

記事 Google Scholar

ミシガン州ジマーマンら。 SARS-CoV-2 シミュレーションはエクサスケールで、プロテオーム全体にわたる劇的なスパイクの開口部と不可解なポケットを予測します。 ナット。 化学。 13、651–659 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、J.ら。 生理学的 C 末端自動プロセシング部位を持つ野生型 SARS-CoV-2 の主要プロテアーゼ アシル酵素中間体の結晶構造。 ナット。 共通。 11, 5877 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ネラー、DW et al. SARS-CoV-2 3CL Mpro活性部位空洞の構造可塑性が室温X線結晶構造解析によって明らかになった。 ナット。 共通。 11、7–12 (2020)。

記事 Google Scholar

チェン、H.ら。 SARS 3C 様プロテイナーゼの二量体では、1 つのプロトマーのみが活性です。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 281、13894–13898 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cho、E.ら。 β-コロナウイルス 3CL Mpro プロテアーゼ リガンド結合部位の動的プロファイリング。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 情報モデル。 61、3058–3073 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grottesi、A. et al. SARS-CoV-2 3CLpro の計算研究: MD シミュレーションからの洞察。 内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 21、1–18 (2020)。

記事 Google Scholar

マシップ、G.ら。 急いで無駄を作る：SARS-CoV-2 メインプロテアーゼ (M-pro) 阻害の薬物再利用におけるドッキングベースの仮想スクリーニングの批判的レビュー。 医学。 解像度改訂 42、744–769 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Constant, DA、Mateo, R.、Nagamine, CM & Kirkegaard, K. デング熱ウイルスのトランスドミナント阻害のための分子内プロテイナーゼ NS2B/3 切断の標的化。 手順国立アカデミー。 科学。 米国 115、10136–10141 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジン、Z.ら。 SARS-CoV-2 由来の Mpro の構造とその阻害剤の発見。 ネイチャー 582、289–293 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Qiao, J. et al. トランスジェニックマウスモデルにおいて抗ウイルス活性を有する SARS-CoV-2 Mpro 阻害剤。 サイエンス 371、1374–1378 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaidman、D. et al. 不可逆的な誘導体設計のための自動パイプラインにより、強力な SARS-CoV-2 Mpro 阻害剤が特定されます。 細胞。 化学。 バイオル。 12、1795–1806 (2021)。

記事 Google Scholar

ハン、SHら。 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 3CL プロテアーゼ (SARS-CoV-2 3CLpro) を標的とする ML300 由来の非共有結合性阻害剤の構造に基づく最適化。 J.Med. 化学。 65、2880–2904 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

ダンパラ、CS 他。 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2 3CL プロテアーゼの構造的に拘束されたシクロヘキサン阻害剤の構造誘導設計。 J.Med. 化学。 64、10047–10058 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ギュンター、S. 他 X線スクリーニングにより、SARS-CoV-2の主要プロテアーゼの活性部位とアロステリック阻害剤が特定されます。 サイエンス 372、642–646 (2021)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma、C.ら。 ボセプレビル、GC-376、およびカルパイン阻害剤 II、XII は、ウイルスの主要なプロテアーゼを標的とすることで SARS-CoV-2 ウイルスの複製を阻害します。 細胞。 解像度 30、678–692 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Douangamath、A. et al. SARS-CoV-2 主要プロテアーゼの結晶学的および求電子フラグメントのスクリーニング。 ナット。 共通。 11、1–11 (2020)。

記事 Google Scholar

Zhao, Y. et al. レプリカーゼポリタンパク質切断の構造基盤とSARS-CoV-2の主要プロテアーゼの基質特異性。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 119、e2117142119 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai, B. et al. 6員環ラクタムP1グルタミン模倣を備えたペプチド模倣α-アシルオキシメチルケトン弾頭: SARS-CoV-2 3CLプロテアーゼ阻害、コロナウイルス抗ウイルス活性、およびインビトロ生物学的安定性。 J.Med. 化学。 65、2905–2925 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

ネラー、DW et al. SARS-CoV-2の主要なプロテアーゼの珍しい両性イオン触媒部位が中性子結晶構造解析によって明らかになった。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 295、17365–17373 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, S.、Jonas, F.、Shen, C. & Higenfeld, R. ウイルスポリタンパク質からの SARS-CoV 主要プロテアーゼの遊離: N 末端自己切断は成熟二量体化モードに依存しません。 タンパク質細胞 1、59–74 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、C.ら。 重症急性呼吸器症候群（SARS）コロナウイルス3C様プロテイナーゼの成熟機構。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 285、28134–28140 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホー、BLら。 MERS コロナウイルスの主要プロテアーゼの二量体化と触媒作用に関与する重要な残基の批判的評価。 PLoS One 10、e0144865 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Aslanidis, C. & de Jong, PJ PCR 産物のライゲーション非依存性クローニング (LIC-PCR)。 核酸研究所 18、6069–6074 (1990)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

研究者、FW 高密度振盪培養における自動誘導によるタンパク質生産。 タンパク質指数プリフ。 41、207–234 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウィルキンス、MR 他。 ExPASy サーバーのタンパク質の同定および分析ツール。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 112、531–552 (1999)。

CAS PubMed Google Scholar

Zheng、SQら。 MotionCor2: クライオ電子顕微鏡法を改善するためのビーム誘起運動の異方性補正。 ナット。 方法 14、331–332 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジバノフ、J.ら。 RELION-3 での自動高解像度クライオ EM 構造決定のための新しいツール。 Elife 7、e42166 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

A、R. & N、G. CTFFIND4: 電子顕微鏡写真からの高速かつ正確なデフォーカス推定。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 192、216–221 (2015)。

記事 Google Scholar

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO は、クライオ EM 用の高速かつ正確な完全自動粒子ピッカーです。 共通。 バイオル。 2、1–13 (2019)。

記事 Google Scholar

J, Z., T, N. & SHW, S. クライオ EM 単粒子解析におけるビーム誘起運動補正へのベイジアン アプローチ。 IUCrJ 6、5–17 (2019)。

記事 Google Scholar

Punjani, A.、Rubinstein, JL、Fleet, DJ & Brubaker, MA CryoSPARC: 教師なしの迅速なクライオ EM 構造決定のためのアルゴリズム。 ナット。 方法 14、290–296 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schheres、SHW & Chen、S. クライオ EM 構造決定におけるオーバーフィッティングの防止。 ナット。 メソッド 9、853–854 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A.、Zhang, H.、および Fleet, DJ 不均一改良: 適応正則化により、単一粒子のクライオ EM 再構築が向上します。 ナット。 方法 17、1214–1221 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

タン、YZら。 傾斜による単粒子クライオ EM での好ましい試料の配向に対処します。 ナット。 方法 14、793–796 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

EF、P.ら。 UCSF ChimeraX: 研究者、教育者、開発者向けの構造視覚化。 タンパク質科学。 30、70–82 (2021)。

記事 Google Scholar

Terwilliger, TC、Sobolev, OV、Afonine, PV & Adams, PD 詳細と接続性の最大化による自動マップの鮮明化。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 74、545–559 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アフォニン、PV 他。 PHENIX におけるクライオ EM および結晶学のための実空間リファインメント。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 74、531–544 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P.、Lohkamp, B.、Scott, WG & Cowtan, K. オオバンの特徴と開発。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 66、486–501 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、VBら。 MolProbity: 高分子結晶学の全原子構造検証。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 66、12–21 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Punjani, A. & Fleet, DJ 3D 変動解析: 単一粒子クライオ EM からの連続的な柔軟性と離散的不均一性を解決します。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 213、107702 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chalk R.『大腸菌における異種遺伝子発現: 方法とプロトコル』(Burgess-Brown NA 編) 373–395 (Humana Press、ニューヨーク市、2017)。

Kabsch、W. Acta Crystallogr。 D. 構造。 バイオル。 66、125–132 (2010)。 XDS。

記事 CAS Google Scholar

フォンライン、C.ら。 autoPROC ツールボックスを使用したデータの処理と分析。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 67、293–302 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

ウィン医学博士ら。 CCP4 スイートと現在の開発の概要。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 67、235–242 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。 Ｊ．Ａｐｐｌ． クリスタロガー。 40、658–674 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ムルシュドフ、GN 他高分子結晶構造の微細化のための REFMAC5。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 67、355–367 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

エバンス氏、広報、ムルシュドフ氏、GN 私のデータはどの程度優れていますか? 解像度はどれくらいですか? アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 69、1204–1214 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Karplus, PA & Diederichs, K. 結晶学的モデルとデータ品質のリンク。 サイエンス 336、1030–1033 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロング、F.ら。 AceDRG: リガンドの立体化学記述ジェネレーター。 アクタクリスタログル。 D. 構造。 バイオル。 73、112–122 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エルババ、TJ 他 SARS-CoV-2 主要プロテアーゼのアロステリック阻害: 質量分析ベースのアッセイからの洞察。 アンジュー。 化学。 内部。 エド。 59、23544 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Winkler, R. ESIprot: エレクトロスプレー イオン化質量分析データからタンパク質の荷電状態を決定し、分子量を計算するための汎用ツールです。 急速なコミュニケーション。 マス SP 24、285–294 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

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著者らは、Wellcome Trust、MRC、BBSRC の資金提供を受けた提案 BI27083 および NT29349 を通じて、英国国立電子バイオイメージング センター (eBIC) のクライオ EM 施設へのアクセスとサポートについて、Diamond Light Source に感謝しています。 著者らは、化合物を供給したCOVID Moonshot Consortiumと、親切にもニルマトレルビルを供給したカルロス・アルベルト・モンタナリ教授に感謝している。 ASG は、Andressa Patricia Alves Pinto の SEC-MALS へのサポートに感謝します。 このプロジェクトは、Nível Superior Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – Project 88887.516153/2020-00、ASG) および Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP プロジェクト 2013/07600-3、2015/16811-) から資金提供を受けました。 3および 2016/19712-9、GO)。 この研究は、EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaining (EUbOPEN 助成金番号 875510、RC) の支援を受けています。 この研究は、ブラジル科学技術イノベーション省 (MCTI) の監督下にある民間非営利団体であるブラジルエネルギー・材料研究センター (CNPEM) の一部である SIRIUS の施設を使用しました。 MANACA ビームラインのスタッフは、提案 20220605 の実験中の協力に感謝します。この出版物で報告された研究は、賞番号 U19AI171399 で国立衛生研究所の NIAID によって部分的に支援されました。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 ロビンソン研究室での研究は、医学研究評議会 (MRC) プログラム助成金 (MR/V028839/1) によって支援されています。 この研究は、ウェルカム トラストの助成金番号 221795/Z/20/Z からも一部資金提供を受けました。 TJE はリナクル大学のジュニア研究員であり、英国王立協会ニュートン国際フェローシップの支援を受けています。 TJE と CVR は、オックスフォード大学 新型コロナウイルス感染症研究対応基金とその寄付者 (BRD00230) から提供された寛大な支援に感謝しています。

これらの著者は同様に貢献しました: Gabriela Dias Noske、Yun Song。

メンバーとその所属の完全なリストは補足情報に記載されています。

サンパウロ物理学研究所、サンパウロ大学、Av. Joao Dagnone、1100 - Jardim Santa Angelina、サン カルロス、13563-120、ブラジル

ガブリエラ・ディアス・ノスケ、ラファエラ・サシェット・フェルナンデス、グラウシウス・オリバ、アンドレ・シュッツァー・ゴドイ

電子バイオイメージング センター、Diamond Light Source Ltd.、ハーウェル サイエンス アンド イノベーション キャンパス、ディドコット、OX11 0QX、英国

ユン・ソン & C. デヴィッド・オーウェン

オックスフォード大学医薬品発見センター、OX1 3QU、オックスフォード、英国

ロッド・チョーク、ハイテム・エルマスーディ、リズベ・コエケモア

オックスフォード大学化学部物理理論化学研究所、South Parks Road、OX1 3TA、オックスフォード、英国

タリック・J・エルババ＆キャロル・V・ロビンソン

カブリナノサイエンス発見研究所、Dorothy Crowfoot Hodgkin Building、South Parks Road、OX1 3QU、オックスフォード、英国

タリック・J・エルババ＆キャロル・V・ロビンソン

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ASG がこのプロジェクトを発案しました。 GDN は生化学的および生物物理学的実験を実施しました。 YS はグリッドとデータ収集を準備しました。 ASG と YS はクライオ EM データを処理しました。 ASG と GDN はモデリングと分析を実行しました。 LK、HE、RC、THE、CVR は MS 実験を実施しました。 ASG がこの原稿を書き、考案しました。 ASG、RSF、YS、CDO、GO がこの原稿を改訂しました。

アンドレ・シュッツァー・ゴドイへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Jeffrey Agar、Stephen Harding、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Noske、GD、Song、Y.、Fernandes、RS 他。 SARS-COV-2 の主要なプロテアーゼの成熟プロセスと阻害の溶液内スナップショット。 ナットコミューン 14、1545 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

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受信日: 2022 年 8 月 1 日

受理日: 2023 年 2 月 28 日

発行日: 2023 年 3 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

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