海洋細菌に対するビオチン前駆体の見過ごされている役割

ISME Journal volume 16、pages 2599–2609 (2022)この記事を引用する

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7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ビオチン (ビタミン B7) は、幅広い必須の生化学反応に関与しており、多くの原核生物および真核生物にとって不可欠な微量栄養素です。 世界の海洋におけるビオチンの数少ない測定結果は、利用可能量が大きく変動することを示しています。 多くの海洋微生物はビオチン栄養要求性を示すため、他の生物による供給に依存しています。 デスチオビオチンはビオチンの主な前駆体であり、最近、海水中のビオチンと同様の濃度で検出されました。 ビオチン生合成経路の最後の酵素反応は、ビオチン合成酵素 (BioB) を介してデスチオビオチンをビオチンに変換します。 しかし、微生物系におけるビオチン合成の前駆体としてのデスチオビオチンの役割はほとんどわかっていません。 今回我々は、細菌がbioB遺伝子を保持し、デスチオビオチンが利用可能であれば、細菌がビオチン栄養要求性を克服できることを実験的に実証する。 1,068 個の細菌のゲノム検索により、ビオチン生合成の潜在力は異なる系統群間で大きく異なり、20% は bioB のみをコードしており、ビオチン栄養要求性を克服できる可能性があると予測されています。 多くのアクチノバクテリアとアルファプロテオバクテリアはビオチンを新たに合成できませんが、一部は bioB のみを保有しますが、ガンマプロテオバクテリアとフラボバクテリアの大多数は最後の 4 つの重要なビオチン合成遺伝子を示します。 我々は、原栄養細菌であるビブリオ・キャンベリにおいて、ビオチンと比較して高い細胞内および細胞外の前駆体濃度を検出し、指数関数的増殖中に細胞外デスチオビオチンが細胞あたり最大1.09±0.15*106分子に達した。 我々の結果は、海洋およびおそらく他の生態系における細菌のビオチン栄養要求性を克服するための逃げ道としてのデスチオビオチンの生態学的役割の証拠を提供する。

ビオチン (ビタミン B7) は、原核生物と真核生物の両方における数多くの生化学反応に関与する必須の補酵素です。 ビオチン依存性酵素は、ピルビン酸カルボキシラーゼ、プロピオニル CoA カルボキシラーゼ、アセチル CoA カルボキシラーゼ、β-メチルクロトニル CoA カルボキシラーゼなどのカルボキシル化反応を触媒します。 これらの不可欠な反応は、糖新生、脂肪酸合成、アミノ酸異化に関与しています[1、2、3]。 細菌にはさらに 2 つのビオチン依存性カルボキシラーゼが存在します。尿素アミドリアーゼは細菌が窒素源として尿素を利​​用できるようにするもので、もう 1 つはイソプレノイドの異化に関与するゲラニル CoA カルボキシラーゼです [4]。 ビオチン生合成経路の基礎は、さまざまな代謝経路 [4] とそれに続く 4 つの酵素、8-アミノ-7-オキソノナン酸シンターゼ (BioF)、アデノシルメチオニン-8-ピメロイル CoA をビオチンに変換するアミノ-7-オキソノナン酸アミノトランスフェラーゼ (BioA)、デスチオビオチン合成酵素 (BioD)、およびビオチン合成酵素 (BioB)。 最後の酵素反応には、デスチオビオチンの飽和 C6 位置と C9 位置との間の硫黄原子の挿入が含まれ、これはシステインに由来すると考えられています [7] (図 1)。 培養実験に基づく現在の推定では、すべての真核生物の植物プランクトンの 90 パーセントがビオチン原栄養生物であることが示唆されています [8、9、10]。 代謝経路の評価におけるビオチンの重要性と細菌ゲノムの入手可能性にもかかわらず、海洋細菌におけるビオチン生合成の可能性は依然としてほとんど解明されていません。 以前の研究では、海洋細菌のビオチン経路潜在性の分類には、デスチオビオチンからビオチンへの最終変換をコードする遺伝子、bioB のみが考慮されていました。 これらの分析は、海洋の代表的なアルファプロテオバクテリアとフラボバクテリアのいくつかはビオチンを合成できない一方、海洋のガンマプロテオバクテリアのほとんどはビオチン原栄養生物であることを示唆しました[10]。 しかし、例えばヒトの腸内など、4つのビオチン経路遺伝子すべてを考慮した細菌群集のビオチン経路潜在力の評価では、多数の細菌がビオチン栄養要求性を示しているにもかかわらず、ビオチン前駆体の回収が重要な役割を果たしている可能性があることが示されている[11]。

細菌で解明されているビオチン生合成経路を示します。 得られる合成生成物との個々の酵素反応が示されています。

過去数十年にわたり、海洋中のビタミンB群の研究において広範囲にわたる発見がなされてきました。 補酵素チアミンとコバラミンに関する広範な研究により、最終補因子の交換が重要であるだけでなく[12]、ビタマー（生合成前駆体または分解生成物を含むビタミンに構造的に関連する化合物）の交差供給も重要であることが示されています。海洋性ビタミンB群サイクリングとの関連性はこれまで過小評価されてきた[13,14,15,16,17]。 海洋プランクトン間のビオチンと生合成代謝産物の必須交換を含む密接な微生物相互作用も、海洋微生物群集にとってのビオチンの重要性を最近強調している[18、19、20]。 最初の刺激的な結果が何十年も前に得られたにもかかわらず、海洋生態系におけるビオチンビタマーの相互摂食に関する研究はまだ初期段階にある[21、22、23、24]。 いくつかの研究では、デスチオビオチンが供給されると、真菌および細菌分離株がビオチン栄養要求性を克服できることが実証されました。 しかし、影響が観察された濃度は不釣り合いに高く、自然条件を反映していませんでした[21、22、23、24]。 さらに、デスチオビオチンの濃度が上昇すると、一部の細菌の増殖が阻害され、他の細菌のビオチン取り込みが抑制されました [23、24、25]。 当時（1940年代初頭）科学者たちから隠されていたが、今日では知られているのは、これらの発見を適切な生態学的文脈に位置づけるための、ビオチン生合成経路に関する酵素的および遺伝的洞察である。 実際、今日では、デスチオビオチンがビオチンの代謝前駆体であり、その変換には酵素 BioB が必要であることがわかっています。 それでも、デスチオビオチンの使用の原因と頻度、その天然の供給源と入手可能性はほとんど不明です。 大西洋のトランセクトに沿って、また東太平洋海嶺からの深海の熱水噴出孔でデスチオビオチンが測定された数少ないケースでは、濃度が部分的にビオチンの濃度を超え、これまでに測定された最高濃度は深層で約 100 pM でした。海の熱水噴出孔 [26, 27]。 海水中のいくつかの溶解ビオチン測定では、最終補因子の強い変動が示され、値は検出限界未満 (<1.2 pM) から最大 700 pM までの範囲でした [27、28、29、30、31]。

私たちは、デスチオビオチンには、海洋微生物群集におけるビオチン栄養要求性を克服するためのまだ認識されていない重要な役割があると仮説を立てています。 したがって、我々は、ビオチン経路の欠如、したがってビオチン栄養要求性の可能性が海洋細菌にどの程度広範囲に存在するのか、そしてデスチオビオチンの利用可能性が栄養要求性の克服にどの程度貢献しているのかを自問しました。 私たちの目標は、現在ほとんど知られていないビオチン前駆体の天然源と環境での利用可能性を決定することでした。 我々はさらに、細菌によるデスチオビオチンの取り込みと変換が環境中の他の栄養要求性微生物にどのような影響を与えるかをより深く理解することを目的としました。

デスチオビオチンの供給により細菌がビオチン栄養要求性を克服できるかどうか、またどの程度効果的に細菌がビオチン要求性を克服できるかをテストするために、ビオチン栄養要求性生物と原栄養性生物を含むと予測されるロゼオバクター群のいくつかの細菌をスクリーニングした[32]。 植物プランクトンと細菌の共培養実験では、デスチオビオチンをビオチンに変換する能力を持つビオチン要求性細菌が周囲の微生物と最終補因子を共有できるかどうかを調べました。 比較ゲノミクスとメタゲノミクスを使用して、海洋細菌間のビオチン経路遺伝子の分布を調査しました。 私たちは、亜南極と北部の温度領域の間で大西洋を横切る緯度横断領域における地表近くの原核生物群集のビオチン生合成の可能性について洞察を得ることができました。 高速液体クロマトグラフィーと結合したタンデム質量分析 (LC-MS) を使用して、ビオチン前駆体であるデスチオビオチンの天然源を同定しました。 私たちの結果は、海洋ビオチン循環に関する新たな洞察を提供し、デスチオビオチンがビオチン欠乏症に苦しむ多くのビオチン要求性細菌に対する効果的な代替品であることを特定し、微生物相互作用におけるビタミンBビタマーの重要な役割を強調しています。

ゲノム配列決定されたRoseobacterグループの代表的な細菌を、ビオチン生合成経路の存在についてスクリーニングした。 私たちの増殖実験研究のために、ビオチン経路の最後の 4 つの酵素反応をコードする遺伝子 (bioF、bioA、bioD、bioB、Pacificibacter marinus DSM 25228、Sediminimonas qiaohouensis DSM 21189、Sulfitobacter sp. DFL-) を欠く 6 つのモデル生物を選択しました。 14) またはビオチン経路の最後の酵素反応の遺伝子のみを保有する (bioB; Celeribacter indicus DSM 27257、Roseovarius mucosus DSM 17069、Sulfitobacter sp. EE-36 DSM 11700)。 株を最初にマリンブロス（MB）培地で増殖させ、次に3回洗浄し（5000gで遠心分離）、人工海水（ASW）培地（ビオチンを含まない）に再懸濁した。 次に、チアミン (ビタミン B1)、リボフラビン (ビタミン B2)、ニコチン酸 (ビタミン B3)、パントテン酸 (ビタミン B5)、塩酸ピリドキシン (ビタミン B6)、およびコバラミン (ビタミン B2) を添加した ASW 培地のみで培養物を増殖させました。考えられる他のビタミン栄養要求性に対抗するために、B12;それぞれ500 pM）、グルコース、酢酸塩およびグルタミン酸塩からなる等量（mM C）の基質混合物（30 mM C）を補充しました。 細菌は、デスチオビオチンとビオチン（各 1 nM）を個別に添加し、陰性対照はそれ以上添加せず、pH 8、20 °C、pH 8、20 °C の三重のガラス試験管内の暗所で 10 ml の培地で振盪機（100 rpm）で培養しました。 。 培地とそれぞれの炭素源を含む 3 つの滅菌試験管を対照として使用しました。 増殖は光学密度(OD600)によって監視した。

ビオチン栄養要求性、単細胞、光合成真核生物のモデル生物として、無菌渦鞭毛藻プロロセントラム ミニマム (CCMP 1329) を木炭処理海水 (北海) 培地で若干の調整を加えて増殖させました。 木炭処理した SW 培地は次のように生成されました。 あらかじめ濾過した（0.2μm）SWに、1リットルあたり10gの活性炭を加え、30分間振盪した。 次に、有機化合物が結合した木炭をボトルトップフィルター (Rapid Flow Bottle Top Filter 0.2 µm、Nalgene、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) で濾過することにより SW から除去しました。 木炭処理した SW には、F/2 培地 [33] について記載されているように、NaNO3 (882 μM)、NaH2PO4 (36.2 μM) および微量金属が補充されましたが、ケイ酸塩は添加されませんでした。 オートクレーブ処理する前に、培地を CO2 で 1 分間フラッシュしました。 チアミン (ビタミン B1)、リボフラビン (ビタミン B2)、ニコチン酸 (ビタミン B3)、パントテン酸 (ビタミン B5)、塩酸ピリドキシン (ビタミン B6) およびコバラミン (ビタミン B12; それぞれ最終濃度 500 pM) を培地に添加しました。他のビタミン要求性の可能性に対抗するため。 ビオチンを含まないP.最小培養物を維持するために、陰性対照で増殖が検出されなくなるまで、渦鞭毛藻を木炭処理SW培地に4回移した。 P.ミニマムの主な実験の前培養物に10pMビオチンをスパイクして、ビオチン汚染源となることなく接種用のP.ミニマムの増殖を最小限に抑えた。 渦鞭毛藻 P. ミニマムを 70 µE で照明した 12:12 時間の明暗サイクルで培養し、20 °C でインキュベートしました。 主な実験の培養物を40 mlの3連で増殖させ、デスチオビオチンまたはビオチン(それぞれ1 nM)またはネガティブコントロールを追加添加せずにスパイクしました。 木炭で処理した海水を入れた滅菌試験管を 3 つずつ陰性対照として使用しました。 渦鞭毛藻培養物の無菌性は、培養物をSybr Greenで染色し、細菌について顕微鏡で検査することによって検証されました。 増殖は相対蛍光によって監視されました。 デスチオビオチンをビオチンに変換できる細菌が別のビオチン栄養要求性生物に必須補因子を供給し、その見返りに有機炭素を受け取るかどうかをテストするために、さまざまな実験条件下で共培養でP.ミニマムとC.インディカスを増殖させました。 最初に、デスチオビオチン (1 nM) を添加し、それ以上添加せずに共培養物を増殖させました。 C. indicus が渦鞭毛藻由来の有機炭素を利用できず、ビオチンを共有できない可能性を排除するために、別の処理では、共培養物にグルコース、グルタミン酸および酢酸を含む有機炭素混合物 (120 μM C​​) を補充しました。 (各基質は 40 μM C​​)。 さらに、渦鞭毛藻の増殖が C. indicus によって阻害されないことを確認するために、細菌と渦鞭毛藻の共培養にビオチン (1 nM) を追加しました。 各実験には、ビオチンを添加せずに増殖させた無菌性のP.ミニマムであるネガティブコントロール、および1nMビオチンを添加して増殖させたポジティブコントロールであるP.ミニマムが含まれていた。 すべての治療は 3 回繰り返して実行されました。 すべての共培養処理について、最初の細菌接種量は 106 細胞 ml-1 であると計算されました。

細菌細胞数のサンプルは、P.ミニマムの定常増殖期に収集され、相対蛍光によって監視されました。 細菌細胞数を計測するために、サンプルを最終濃度 1% のグルタルジアルデヒド (GDA) で固定し、さらなる分析まで -20 °C で保存しました。 フローサイトメトリーによる計数の前に、ガラスビーズ (2.3 mm) と超音波処理 (35 °C、70%、4 × 5 分、Sonorex、Bandelin、Berlin、Germany) を使用して、短いボルテックスを使用して細菌細胞を渦鞭毛藻細胞から分離しました。各超音波間隔の後にステップ (2 × 2 秒、Vortex Genie2、Scientific Industries Inc.、ニューヨーク、米国)。 この方法は、他の場所で説明されている分離方法をさらに発展させたものです [34]。 続いて、他の場所で記載されているように、サンプルを Sybr Green で染色し、フローサイトメーター (BD Biosciences Accuri C6; BD Biosciences、Franklin Lakes NJ、USA) を使用して計数しました [35]。

ビブリオ キャンベリ (DSM 19270) は、最初に MB 培地で増殖させ、他の場所で記載されているように [36] わずかな変更 (補足データセット 1) を加えて自己誘導物質バイオアッセイ (AB) 培地に移し、ビタミンフリー AB 培地で 3 回洗浄した後、 AB培地での主実験の接種。 1400 ml の培養液には単一炭素源としてグルタミン酸 (10 mM C) が補充され、ビタミンは添加されませんでした。 増殖をOD600によって監視し、さらに、フローサイトメトリーによる細菌細胞の計数のためにサンプルを無菌的に収集した。 フローサイトメトリー用のサンプルは 2% GDA で固定し、4 °C で 30 分間インキュベートし、以前に記載されているように分析するまで -20 °C で凍結しました [35]。 細胞内および細胞外のビオチンおよびデスチオビオチン測定用のサンプルは、指数関数的増殖期中期および後期、ならびに定常期初期に無菌的に採取されました。 細胞内ビオチンおよびデスチオビオチン分析のために、50 ml の V. キャンベリ培養物を遠心分離 (5000 g) によってペレット化し、分析まで -20 °C で凍結しました。 細胞外ビオチンおよびデスチオビオチン分析のために、150 ml の培養物を 0.22 μm ボトルトップフィルター (PES ボトルトップフィルター、Nalgene Thermo Scientific) を通して濾過し、分析まで -20 °C で凍結しました。

ビオチンおよびデスチオビオチン分析用のサンプルは、2019 年 7 月のクルーズ中に RV ゼンケンベルクのジャーマン バイト (北海) で海面下 1 m の 3 つの異なるサンプリング ステーションで収集されました (サンプル 1: 北緯 53 度 34 分 35 秒、8 °10'14"E; サンプル 2: 53°58'14" N、8°36'55" E; サンプル 3: 54°45'38" N、8°12'0" E; サンプル 4: 54° CTDロゼットに取り付けられた5 l-Niskinボトルを使用した35'13 "N、6°59'26"E）（補足図S1A）。 水サンプルはボード上でろ過され（0.22 µm、混合セルロースエステル、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）、さらなる分析まで 4 °C で保存されました。

培地および海水からの細胞外ビオチンおよびデスチオビオチンの抽出は、20 ml のメタノールと 20 ml のメタノールで調整した固相抽出カラム (Bond Elut PPL、1 g、Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) で実行しました。 Ｈ２Ｏ（３７％塩酸でｐＨ６に調整）。 濾過した北海の水サンプルと細菌のエキソメタボロームサンプルを塩酸 (37%) で pH 6 に調整し、カラムに通しました。 ｐＨ６のＨ ２ Ｏ １０ｍｌを使用してカラムから残った塩を洗浄し、分析物をメタノール８ｍｌで溶出した。 溶媒を窒素ガス流下で蒸発させ、乾燥サンプルを前述のようにさらに処理しました[37]。 細胞内ビオチンとデスチオビオチンの抽出には、細菌のコエンザイム A チオエステルの分析について記載された方法の修正版が適用されました [37]。 凍結細胞ペレットをメタノール 1 ml に再懸濁し、ビーズビーターでの均質化によって直接粉砕しました。 さらにメタノール０．５ｍｌで抽出を２回繰り返し、窒素気流下で溶媒を留去した。 他のすべてのステップは、以前に説明されているように実行されました [37]。 ろ過されたすべての抽出物は、ポジティブ モード (HESI + ) の加熱エレクトロスプレー イオン化を備えた TSQ Quantum AM トリプル四重極質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) で分析されました。 ソースパラメータは以下の通りであった：スプレー電圧３０００Ｖ、気化器温度４００℃、移送管温度３４０℃、シースガス６０任意単位、補助ガス２０任意単位。 選択した反応監視モードのパラメータは、サポート情報 (補足表 S1) にリストされています。 Kinetex Evo C18 カラム (100 × 2.1 mm、孔径 2.6 μm、Phenomenex、米国カリフォルニア州トーランス) を備えた Ultimate 3000 HPLC (Thermo Fisher Scientific) を質量分析計に接続して、個々の分析物の分離を実現しました。 各サンプルの注入量は 5 µl で、使用した溶離液は 10 mM ギ酸アンモニウム (pH 6.0; A) とアセトニトリル (B) で、溶媒勾配は次のとおりです: 0 ～ 13 分 100 ～ 75% A。 13 ～ 15 分 75 ～ 0% A; 15 ～ 19 分 0% A; 19 ～ 21 分 0 ～ 100% A; 21 ～ 26 分 100% A. ビオチンとデスチオビオチンを、ビオチンとデスチオビオチンを添加し、同様に処理した海水および細菌サンプルを使用したマトリックスの影響下での回収実験と組み合わせて、市販の標準化合物を使用した外部キ​​ャリブレーションによって定量しました。 標準シグナルを使用したクロマトグラムと MS フラグメント スペクトルの例については、補足図 S2–5 を参照してください。 増殖曲線中のさまざまな時点で V. Campbellii によって放出されるビオチンまたはデスチオビオチン分子の数についてより正確な結論を引き出すために、細胞あたりの検出分子数を計算しました。

公的に利用可能なゲノムは、Joint Genome Institute Integrated Microbial Genomes with Expert Review データベース (2021 年 11 月 3 日にアクセス) (JGI/IMG/MER、https://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/mer/main) からダウンロードされました。 cgi）。 ゲノムをダウンロードするための以前の条件は、生態系カテゴリが「水生」、配列決定ステータスが「永久ドラフト」または「完了」でした。 すべてのゲノムの完全性を検証するために、我々が適用したアプローチは、(参考文献 [38]) に記載されているものに若干の変更を加えたものでした。 つまり、55 個の単一ハウスキーピング遺伝子コピーがすべてのゲノムで検索され [39, 40]、その後、厳格な選択を適用して、53 個未満のハウスキーピング遺伝子を持つすべてのゲノムを削除しました。 複数の割り当てられた種が単一のゲノムに縮小され、ハウスキーピング遺伝子の数が最も多い種が代表として選択されました。 種ではなく属に割り当てられた株は 1 つのグループとみなされ、1 つのゲノムにまとめられ、ハウスキーピング遺伝子の最大数に従って選択されました。 種のリストで種の重複がないか手動でチェックしました。

ダウンロードされたすべてのゲノムから合計 1710 のゲノム (61.6%) が削除され、さらなる分析に利用できる 1068 のゲノムが残されました。 「KEGG オーソロジー (KO) - ビオチン代謝」に含まれるビオチン生合成経路の遺伝子は IMG/MER にダウンロードされ、各酵素の「KEGG 機能 ID」と「EC 番号」が含まれています。 同定されたビオチン代謝酵素が 1068 ゲノムに存在するかどうかを検証するために、「機能プロファイル: 機能 vs. ゲノム」ツールを適用しました。 ビオチン代謝経路が存在するかどうかを判断するために、我々は遺伝子「bioF」、「bioA」、「bioD」、および「bioB」に特に興味を持ちました (図 1 を参照)。 細菌を「ビオチン原栄養体」として割り当てるための私たちの基準は、4 つの遺伝子すべてが存在することでした。 「bioB」は存在するが、他の 3 つの遺伝子のうち 1 つ以上が存在しない場合、細菌はデスチオビオチン「デスチオビオチン栄養要求性」を回収できると考えられます。 bioB が他の遺伝子と同様に存在しない場合、細菌は「ビオチン栄養要求性」として分類されました。 個々の細菌ゲノムの割り当てに関する詳細な情報は、補足データセット 2 にあります。大西洋微生物叢メタゲノムからの前述の分類群に関連する遺伝子 [41] を使用して、さまざまなビオチン生合成表現型の全体的な存在量を推定しました。 つまり、Illumina 配列データ (European Nucleotide Archive アクセッション番号: PRJEB34453) は、metaSPAdes v3.11.1 [42] を使用して収集され、210 塩基を超えるコンティグからの遺伝子は Prodigal [43] を使用して予測されました。 結果として得られた遺伝子は、USEARCH v10.0.24 (-cluster_fast) [44] を使用して 95% の配列同一性でクラスター化され、重複しない遺伝子セットが得られました。 これらの非重複遺伝子配列は、Kaiju v1.6 [45] と Refseq nr (2018 年 5 月) および原核生物、真核生物、ウイルス配列を含む ProGenomes [46] データベースを使用して分類学的に分類されました。 さらなる方法論の詳細は他の場所で見つけることができます[41]。

bioB のみが存在するが、ビオチン生合成経路の先行遺伝子がすべて存在しないことで、原核生物がビオチン栄養要求性を克服できるかどうかを理解するために、遺伝的ビオチン経路の可能性についてさまざまなアルファプロテオバクテリアをスクリーニングしました。 最後の 4 つのビオチン経路遺伝子が欠如している 3 つの株 (bioF、bioA、bioD、bioB; 図 2A) と、ビオチン合成酵素 (bioB) をコードする遺伝子のみが存在する 3 つの株 (図 2B) を選択しました。

A、B 以下のそれぞれの増殖実験の細菌分離株のビオチン経路遺伝子の存在を示します (A 最後の 4 つのビオチン遺伝子が欠落しています。B は bioB のみが存在します)。 C-H 異なるビオチン生合成経路ポテンシャル（C、E、およびG ビオチン栄養要求性; D、F および H デスチオビオチン栄養要求性)。

試験した細菌のうち、ビオチン経路の 4 つの遺伝子すべてを欠く 2 つの細菌、P. marinus (図 2C) と Sulfitobacter sp. デスチオビオチンを添加した場合、DFL-14 (図2G) は増殖せず、S. qiaohouensis はビオチンの添加と比較して著しく低い増殖収率を示した(図2E)。 Celeribacter indicus (図 2D)、R. mucosus (図 2F)、および Sulfitobacter sp. EE-36 (図 2H) はすべて bioB を有しており、デスチオビオチンをビオチンに変換する最後の酵素反応を可能にし、異なる増殖特性を示しました。 C. indicus はビオチンまたはデスチオビオチンのいずれかを添加すると増殖しましたが、どちらも添加しなかった場合は増殖しませんでした。補足しました。 C. indicus の増殖速度と収量は、ビオチンまたはデスチオビオチンのいずれかを 1 nM の濃度で添加した場合に有意な差はありませんでした。 同様の結果が R. mucosus でも観察され、ビオチンまたはデスチオビオチンの添加により増殖の大幅な増加が観察され、2 つの添加の間で増殖速度や収量に有意な差はありませんでした (補足表 S2)。いずれかの化合物の添加。 スルフィトバクター属一方、EE-36はビオチン添加のみで増殖したが、デスチオビオチンを添加すると増殖は観察されなかった。 測定は光学密度に基づいているため、R. mucosus では観察された違いの原因は細胞数ではなく細胞サイズである可能性を排除できませんが、それでもデスチオビオチンの添加が影響を及ぼしているようです。

私たちは、この海産渦鞭毛藻がビオチンに対して栄養要求性であるかどうかを調べるために、ビオチンの有無にかかわらず P. ミニマムを培養しました。 相対蛍光で示されるように、ビオチンの添加のみでP.ミニマムの増殖が可能になりました（補足図S6）。 P.ミニマムがデスチオビオチンの添加によってそのビオチン要求性を克服できるかどうかをテストするために、本発明者らはP.ミニマムに1nMデスチオビオチンを補充したが、増殖は観察されなかった。

ビオチンの添加のみが P. ミニマムの増殖につながることを知って、我々は、デスチオビオチンの添加によってそのビオチン要求性を克服できる C. インディカスと P. ミニマムを増殖させる共培養実験を実施しました (上記の図を参照)。 2D）。

P.ミニマムの増殖は、相対蛍光によってモニターされ、ビオチンを添加した場合にのみ観察されました。 共培養物へのデスチオビオチンの補充は、P.ミニマムの増殖をもたらさなかった。 C. indicus が P. minimum によって放出される有機炭素源を利用できないことがないことを確認するために、デスチオビオチンの添加と同時に基質も共培養物に添加しました。 初期の定常増殖期に測定された細菌細胞数は、細菌の増殖が増加しているにもかかわらず、P.ミニマムの増殖に必要なビオチンの放出がないことを証明しています（補足図S6）。

天然のビオチン源といくつかの海洋生態系におけるその利用可能性はすでに判明している [27,28,29,30]が、誰がどのようにデスチオビオチンを放出するのか、また広い海洋域でのその濃度はこれまでのところほとんど解明されていない[26、27]。 質量分析法を使用して、成長期の3つの時点でのV.キャンベリ（ビオチン原栄養体）の培養物と、北海で収集された4つの海水サンプルの細胞内および細胞外でビオチンとデスチオビオチンを測定しました（図3および補足図）。 S1)。 ビオチンとデスチオビオチンは、細胞内ではそれぞれ99％の回収率で分析され、細胞外では回収率30％と29％、検出限界（LOD）はそれぞれ0.15pMと0.03pMで分析されました（補足表S3）。 細胞内サンプルと細胞外サンプルの両方で、細胞あたり検出されたビオチン分子の数は、細胞あたり 42 ± 3.7 ～ 1267 ± 280.1 分子の間で比較的低かった。 検出された細胞外デスチオビオチンの数ははるかに多く、V. キャンベリの定常増殖期では細胞あたり 1.09 ± 0.15*106 分子に達しました。 細胞内と細胞外のデスチオビオチン濃度の間には、顕著な変動が観察されました。 細胞あたりのデスチオビオチン分子の細胞内数は、指数関数期中期では 4.4 ± 0.91*104、指数関数期後期では 8.1 ± 0.87*105、定常期初期では 7.2 ± 0.27*105 に達しました。 対照的に、細胞あたりの細胞外デスチオビオチン分子は、指数関数期後期中期から定常期初期にかけて連続的に減少し、細胞あたり 9.3 ± 0.15*106、1.6 ± 0.38*104、および 2.2 ± 0.62*103 分子となりました。

ビタミンB群を添加しないグルタミン酸塩上でのV.キャンベリの増殖を、フローサイトメーターの細胞数で経時的に監視。 バーは、V. キャンベリの指数関数的増殖期、指数関数的後期期および定常増殖期後期におけるビオチン (オレンジ色) およびデスチオビオチン (黄色) の濃度を細胞外 (空白のバー) および細胞内 (縞模様のバー) で示します。

調べた北海の海水サンプル 4 つすべてでビオチンが検出されましたが、デスチオビオチンはそのうちの 1 つでのみ検出され、その濃度は 2.8 ± 0.1 pM でした。 サンプリング場所（河口、海岸近く、外海）に関係なく、ビオチン濃度はすべて、12.2±0.1から19.8±0.6pMの範囲の比較値でした（補足図S1）。

どの細菌がビオチンを合成する遺伝的能力を欠いているか、または持っているか、またはデスチオビオチンの提供によって起こり得る栄養要求性を克服する可能性が高いかを評価するために、最後の 4 つの酵素カスケード反応をコードする遺伝子 (bioF、bioA、bioD、bioB) の存在を調べました。ビオチン経路の説明 (図 1)。 調査した1068個の細菌ゲノムを考慮すると、ビオチンを合成できない細菌の割合は51.8%、原栄養生物の割合は48.2%である(図4B)。 検査したすべての細菌のうち、20.3% は少なくとも bioB を保有していますが、ビオチン経路の少なくとも 1 つの他の遺伝子を欠いているため、ビオチンまたはデスチオビオチンのいずれかの外因性供給源を必要とします。 この細菌グループでは、62.2% がビオチン経路の最後の遺伝子 (bioB) のみをコードしています。

A B ～ E に示すように、ビオチン生合成表現型 (ビオチン栄養要求性 = 灰色、デスチオビオチン栄養要求性 = 黄色、ビオチン原栄養性 = オレンジ) に細分するための遺伝子の存在を示します。 B-E 水生細菌の 1,068 ゲノムからのビオチン生合成遺伝子が分析され、ビオチン生合成表現型に分類されました。 分析されたすべての細菌 B、門とクラス、アルファプロテオバクテリアの D 目、およびガンマプロテオバクテリアの E 目の相対的な存在量が示されています。

ビオチンを合成する能力には、さまざまな系統発生グループ間に大きな違いが存在します (図 4C)。 たとえば、ベータプロテオバクテリア (76.6%)、ガンマプロテオバクテリア (91.1%)、およびフラボバクテリア (69.3%) の大部分は 4 つの遺伝子すべてを保有しているため、ビオチンを新たに合成できる可能性があります。 遺伝的制約下ではビオチン栄養要求性であるが、デスチオビオチンを使用できる細菌ゲノムの割合は、クロストリジウム菌 (82.9%)、藍藻類 (57.1%)、および桿菌 (29.4%) で特に高くなります。 真のビオチン栄養要求性の最も高い割合は、アルファプロテオバクテリア (57.3%)、デイノコッカス (93.8%)、および放線菌 (46.8%) で見つかりました。 さらに、アルファプロテオバクテリアとガンマプロテオバクテリアを目の分類レベルで調べました。 特にアルファプロテオバクテリアの目は、ビオチン生合成能力に大きな違いを示します (図 4D)。 SAR11クレードとハイホ微生物目、ロドバクテラル目、ロドスピリラ目の大部分は、ビオチン生合成をコードする遺伝子や、デスチオビオチンによる救済を可能にする遺伝子をコードしていません。 対照的に、カウロバクテラル目の大多数はデスチオビオチンを回収する能力を有しており、調査されたスフィンゴモナダ目のほとんどはビオチン合成のためのすべての遺伝子を持っています。 ガンマプロテオバクテリア内のビオチン経路の潜在的変動は低く、ビオチン原栄養生物がすべての目で優勢でした（図 4E）。

原核生物群集におけるビオチン経路の可能性に関するゲノム発見の生態系への影響を理解するために、私たちはゲノム解析をメタゲノム参照カタログにリンクしました。 したがって、我々は、すべての生物地理的地域をカバーする南緯 62 度から北緯 47 度までの大西洋を横断する緯度トランセクトの表面近くのメタゲノムで同様の分析を実行しました [41]。 ビオチン経路の可能性を説明できた原核生物コミュニティの割合 (全遺伝子の全リードのシェア) は、2.8% から 11.9% の間で変動しました。 赤道直下の地域にはシアノバクテリアなど、個々のゲノム配列が決定された代表的な生物が大量に存在するため、分析対象の群集内の既知のゲノムの割合が大幅に増加する可能性があります。 分析および表現された原核生物群集は単一のサンプリング地点からのものであり、特定の海洋州の群集内の一時的または季節的変化を反映していません。

ビオチン原栄養性細菌の割合は、トランセクト全域のほとんどの地域で断然最大であり、特に熱帯と亜熱帯で多くなります（図 5B）。 しかし、南部の温帯および亜南極地域では、ビオチン栄養要求体のシェアが群集全体の少なくとも半分を占めています。 デスチオビオチンを使用してビオチンを合成し、これらの領域で潜在的な栄養要求性を克服できる原核生物の割合は、全体の 8.5 ～ 13.1% の範囲であり、栄養要求性群集の 14.8 ～ 26.1% に相当します。 北部の温帯大西洋では、ビオチン原栄養生物の割合が依然として少なくとも3分の2を占めており、残りの3分の1は、ビオチンを新たに合成できない原核生物と、デスチオビオチンを使用することで潜在的な栄養要求性を克服できる原核生物にほぼ均等に分割されています（図5B）。 ）。

A 示されているのは、B に示されているビオチン生合成表現型 (ビオチン栄養要求性 = 灰色、デスチオビオチン栄養要求性 = 黄色、およびビオチン原栄養性 = オレンジ) への細分化のための遺伝子の存在です。 南極海の南緯 62 度から南極 47 度までの 22 の観測点 (黒い点) を示す地図北大西洋の°N、RV Polarstern によるクルーズ中に水深 20 m でサンプリングされました。 最後の 4 つの酵素的ビオチン生合成遺伝子をコードする海洋細菌 (ビオチン原栄養株、オレンジ)、完全なビオチン経路を欠いているが少なくとも bioB をコードする細菌 (デスチビオチン栄養要求株、黄色)、およびビオチン生合成経路遺伝子を欠いている細菌 (ビオチン栄養要求株、グレー) は、個々のサンプリングステーションの円グラフに表示されます。 各円グラフに示されたパーセンテージは、原核生物群集全体のビオチン生合成能 (16 S rRNA 遺伝子によって識別される) が検出された、ゲノム配列決定された原核生物の割合を表します。 年間の表面クロロフィル a 濃度 (mg m-3) が緑色のスペクトルで示されます。

1901 年にはビオチンが成長促進因子として特定され [47]、続いて 1941 年にその単離と精製が行われ [48]、その後数多くの重要な発見がなされました。 いくつかの原核生物および真核生物がビオチン栄養要求性であることが確認されており、ビオチンビタマーの成長促進効果が観察されています[21、22、23、24、49]。 それ以来、ビオチンは、海洋生態系において広く知られ広く研究されている他のビタミン B 群、チアミン、コバラミンと比較して、ほとんど無視されてきました [12,13,14,15,16,17]。

近年のゲノム配列決定の大きな進歩にもかかわらず、海洋生態系におけるビオチンの栄養要求性および原栄養性の重要性と分布は、ほとんど解明されていないままです。 Sañudo-Wilhelmy らの研究のおかげで、 (2014) [10]、多くの海洋細菌がビオチンを新たに合成できないという最初の兆候がありました。 しかし、ビオチン合成因子の決定に関して、著者らはビオチンカスケード経路の最後の酵素反応を触媒するbioBの存在のみを説明した。 私たちの研究では、ゲノム的にビオチンを新たに合成できないと予測されているすべての細菌のうち、39.2% が依然として遺伝子 bioB をコードしていることを示しました。 私たちの結果を踏まえると、Sañudo-Wilhelmy らによる調査はおそらく、 (2014) いくつかの細菌をビオチン原栄養生物として誤って特定しました。 ここで示した結果は、クラスレベルに至るまでの分類群間でのビオチン生合成能の幅広いばらつきを反映しています。 たとえば、アルファプロテオバクテリアの大部分は完全なビオチン経路を示しません。 共培養および定義されたコンソーシアムにおけるビオチンの交差摂食に関する研究（ビオチンは真核藻類から放出され、通常はアルファプロテオバクテリアのビオチン要求性細菌によって取り込まれる）は、我々のデータを裏付けている[18、19、20]。 SAR11、SAR116、ロドバクテラル目などのアルファプロテオバクテリアの主要な目からの海洋生態系におけるビオチン合成遺伝子のトランスクリプトーム発現も、このサブクラスのビオチン依存性を反映しており[50]、SAR11クレードの豊富なメンバーが、 Candidatus Pelagibacter ubique はビオチン栄養要求性菌です [51]。 さらに、我々の評価は、ガンマプロテオバクテリアとフラボバクテリアの両方の大多数がビオチン合成のための遺伝的要件を備えていることを示しています。 繰り返しますが、ビオチン遺伝子発現は、これら 2 つの分類分類が自然界の主要なビオチン生産者であることを裏付けています [50]。

一般に、我々の評価は、すべての水生細菌の約半数がビオチンを新たに合成できることを示唆しています (図 4B)。 海洋生態系における実際のビオチン合成の可能性をさらに明らかにするには、個々の代表的な生物の豊富さを考慮する必要があります。 私たちの分析は、特定の原核生物群集の 2.8% ～ 11.9% しかカバーしていませんが、亜熱帯および熱帯海洋地域では、この研究で考慮された細菌の大部分がビオチンを新たに合成できるのに対し、南部の温帯および亜寒帯ではビオチンを合成できることがわかります。調査対象となっているビオチン栄養要求性細菌と思われる細菌の割合は 50% を超える可能性があります。 この発見は、原核生物群集のビオチン生合成能力が大きく異なる可能性があることを示唆しており、生物地球化学とビオチンの循環を総合的に理解するには、今後微生物群集の構成にさらに注意を払う必要があると考えられます。 たとえばコバラミン [17, 52] で示されているように、ビオチン欠乏が海洋の浮遊生物に影響を与えるかどうかは、現時点では不明です。 しかし、ビオチンについては、バッチ培養において pM 値が低くても補因子の利用可能性が限られているため、細菌の増殖が制限される可能性があることもわかっています [31、51]。 海水中の溶解ビオチンの比較的少数の測定では、検出限界未満 (<1.2 pM) から 700 pM までの範囲にわたる大きな変動が明らかになりました [27、28、29、30、31]。 特に、季節変動の激しい温帯地域では、地表水中のビオチン濃度はピコモル濃度の低い範囲、または検出限界を下回っています[30]。 北海の水サンプルでも同様の傾向が観察され、濃度はわずか 19.8 ± 0.6 pM、またはそれ以下に達しました。 興味深いことに、私たちのゲノム分析は、特に過去に最低ビオチン濃度が測定された地域では、潜在的にビオチン栄養要求性細菌の割合が特に高く、調査した細菌群集の最大半分以上に達していることを示しています。 低濃度の溶解ビオチンは生産と消費の速度を表すものではなく、急速な微生物の代謝回転を示唆していますが、海洋の原核生物群集に対するビオチンの利用可能性の影響にとって重要であるとして、北半球と南半球の高緯度を調査することは特に有望であると思われます。

解析されたすべての水生ゲノム解読細菌の推定半数は、ビオチンを新たに合成することができないため、ビオチン栄養要求性を患い、これらの生態系内の他の微生物による供給に依存している可能性があります。 ここで提示された重要な結果は、潜在的なビオチン栄養要求性細菌の大部分が、ビオチン経路の最終段階を触媒するビオチン合成酵素（bioB）の遺伝子をコードしているため、ビオチン前駆体であるデスチオビオチンが利用可能であれば、おそらくそれらの栄養要求性を克服できる可能性があるということである。 実際、我々は、ビオチン合成酵素のみを有する 2 つの細菌が、低濃度のデスチオビオチンを供給することでビオチンの必要量を克服し、ビオチンを供給した場合と同じ増殖速度に達することができることを実験的に実証しました。 デスチオビオチンがビオチントランスポーターであるエネルギー結合力トランスポーターである BioMNF を介して細胞に侵入するのか、それとも YigM を介して細胞に侵入するのかは、現時点では不明のままである [53]。 1940 年代には、一部のビオチン栄養要求性細菌がデスチオビオチンの添加により増殖できることが観察されました [22、23]。 さらに 20 年後、個々の海洋細菌もデスチオビオチンの存在下でビオチン栄養要求性を克服できることが初めて示されました [21]。 当時行われた実験とは対照的に、我々は自然の海洋環境でも見られる濃度を使用しました[28]。これは、デスチオビオチンの自然濃度が細菌のビオチン要求性を克服するのに十分であることを示しています。 細菌に加えて、真菌もビオチン栄養要求性を克服するためにデスチオビオチンを使用できます[23、24、49]。 菌類以外の真核生物がこの能力を持っているかどうかは、私たちの知る限りではまだ不明です。 これらの発見の生態学的重要性を追求する研究は、当時の知識の状態では困難であり、先細りしました。 ビオチン経路の可能性のゲノム評価に基づいて、我々は、デスチオビオチンを介して潜在的なビオチン要求を克服するさまざまな海洋細菌の広範な潜在的な能力を特定しました。 ビオチンを新たに合成できない細菌全体の 39 パーセントはビオチン合成酵素をコードしており、デスチオビオチンをビオチンに変換する遺伝的基盤を持っています。 しかし、遺伝子 bioB をコードするすべての細菌が、デスチオビオチンが供給された実験室条件下でビオチン要求を克服できるわけではありません。 細菌のビオチン代謝経路の可能性を解釈する際には、遺伝子型から予想される表現型形質と実験的観察との間の矛盾を考慮する必要があります。 ビオチンやデスチオビオチンの添加に関係なく観察された R. mucosus と S. qiaohouensis の増殖について考えられる説明としては、ビオチン合成にはまだ知られていない別の経路が存在するか、一部の細菌が必須のビオチン依存性を回避する方法を発見した可能性があります。 。 後者のシナリオは、コバラミンなどの他のビタミンではすでに知られています[54]が、私たちの知る限り、ビオチンについてはこれまで考慮されていません。 しかし、海洋原核生物群集のすべてのビオチン栄養要求株のうち、bioB をコードすると推定されるビオチン栄養要求株の割合は、分析された細菌群集の 5 分の 1 以上を占める可能性があります (図 5B)。 高い確率でデスチオビオチンをビオチンに変換できる細菌のこの予想外の大部分は、ビオチンの利用可能性の重要性と海洋のビオチン回路におけるデスチオビオチンの役割についての現在の見方に疑問を投げかけています。

多数の水生細菌が bioB 遺伝子をコードしているが、ビオチン経路全体の遺伝的前提条件を失っているという事実は、微生物生態学の一般的な概念にうまく位置づけることができます。 原理的には、他のビタミンB群ですでに観察されているように[14、38]、個々の代謝経路内での遺伝子損失の観察は珍しいことではないようで、ゲノム合理化理論[55]で説明できる。 それにもかかわらず、ビオチン生合成経路を失ったにもかかわらずbioBを維持している細菌の数は注目に値し、デスチオビオチンによる供給が十分に維持されていることを示唆している。 de novo ビオチン合成が失われるのに、ビオチン合成経路の最後の遺伝子が存在する理由は 2 つ考えられます。 (i) これまで知られていなかった代謝反応における BioB の酵素活性。 (ii) ブラッククイーン仮説 (BQH) によって提案されているように、デスチオビオチンをビオチンに変換できるという進化上の利点 [56、57]。 多数の酵素および酵素反応が特定されていますが、多くは未知である可能性が非常に高くなります。 たとえば、SAR11 クレードの非常に豊富なメンバーである Candidatus Pelagibacter ubique は、遺伝子 bioA のみをコードします。 ビオチン経路のこの残存遺伝子がパントテネートの合成において重要な役割を果たす可能性があることが提案されている[51]。 コードされた酵素 BioB が、ビオチン合成に加えて、これまで知られていないが不可欠な代謝反応に関与していると仮定すると、なぜ非常に多くの細菌が合理化されたビオチン経路を持ちながらも bioB を維持しているのかについての説明が得られる可能性があります。 2 番目の説明は、ビタミンや生合成経路の一部などの特定の成長因子の合成に関する遺伝的形質を、これらの化合物の外因性供給が常に利用可能な範囲で細菌が失うことで恩恵を受けるというシナリオを説明しています。 bioB を除いてビオチン経路が失われると、ビオチンは新規合成できないため代謝コストが低下し、ゲノムが合理化されます。 欠点は、その喪失により栄養要求性細菌が必須微量栄養素ビオチンの利用可能性に依存するようになるということです。 bioB を維持すると、自然界のビオチンへの依存が軽減され、ビオチン栄養要求性を克服するための第 2 供給源としてデスチオビオチンを使用できるようになります。 ゲノムが合理化されたデスチオビオチン栄養要求性細菌のもう 1 つの利点は、特に貧栄養海洋地域に住んでいる細菌にとって無視すべきではありません。それは、ビオチン合成の上流に組み込まれるため、2 つの窒素原子を節約できることです。 進化の時間スケールで見ると、これにより、先行するビオチン経路遺伝子の損失が増幅された可能性があります。

bioB の場合のように、経路の単一遺伝子を保持することは、それぞれに必要なビタミンであるデスチオビオチンが海洋生態系の公共財として利用できる場合にのみ重要となる可能性があります。 北海から採取した 4 つの海水サンプルのうち 1 つから、濃度 2.8 ± 0.1 pM のデスチオビオチンが検出されました。 大西洋では、デスチオビオチンはビオチンよりわずかに高い 27 pM で検出されており [27]、太平洋の熱水噴出孔と海底で収集されたサンプルでは、​​デスチオビオチンの濃度はビオチンの濃度よりも著しく高く、最大 100pM に達しました。午後[26]。

デスチオビオチンが環境中に存在し、その分子量が海洋細菌のエキソメタボロームにおけるフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴 MS によって検出されていることはわかっていますが、その天然起源はほとんど不明のままです [58]。 ここで提示した実験結果は、ビオチン原栄養細菌がデスチオビオチンの供給源となり得ることを示しています。 V. キャンベリは（遺伝的および実験的知見に基づいて）ビオチンを新たに合成できるという事実にもかかわらず、ビオチンよりもはるかに高い濃度で、そしてそのエキソメタボロームではさらに高い濃度でデスチオビオチンを細胞内で検出することができました。 細胞内と細胞外のビオチン濃度の不一致は、ビオチンが酵素に共有結合しているという事実に関連している可能性があります。したがって、補因子は細胞内で酵素に結合しているため、私たちの抽出方法では完全には捕捉されない可能性があります。 ビオチンを含むビタミン B が放出されるメカニズムはまだほとんどわかっていません [59]。 デスチオビオチンとビオチンの化学構造は大きく異なり、ビオチンはウレイド基に縮合した硫黄含有テトラヒドロチオフェン環を持っています。 化学構造がビオチンまたはその前駆体デスチオビオチンの輸出入に影響を与えるかどうかは、現時点では不明のままです。 考えられる活性ビオチン輸出メカニズムに関係なく、ビオチンと比較してデスチオビオチンの漏出性が増加していることは、V. キャンベリに対する細胞外値が高いことを説明し、したがってその広範な取り込みと回復の基礎を提供する可能性があります。

これらの結果を総合すると、デスチオビオチンは細菌によって生産および放出され、海洋でのデスチオビオチンの利用可能性は、ビオチン合成酵素を保持するビオチン栄養要求性微生物の満足に大きく寄与する可能性があることを示唆しています。 しかし、細菌によるデスチオビオチンの生合成と放出に加えて、これまでのところほとんど知られていない別の機構が、デスチオビオチンの天然源に大きく寄与している可能性がある。 たとえば、珪藻の場合、デスチオビオチンをビオチンに変換する最後の酵素ステップ (BioB) には鉄が必要であることが示されています。 鉄が枯渇すると、ビオチン合成酵素 bioB の発現が大幅に減少します [60]。 鉄欠乏による遺伝子発現の低下がビオチン合成酵素にのみ影響を与えるのか、それとも以前の酵素反応 (BioF、BioA、または BioD) に影響を与えるのかはまだ特定されていません。 ビオチンカスケード経路のフィードバックループなしでビオチン合成酵素を阻害すると、過剰なデスチオビオチンとその後の放出につながる可能性があります。 特に、大西洋の南部温帯および亜南極地域は、珪藻が植物プランクトン群集の大半を占め、鉄分制限が一般的である典型的な地域である[52、61]。 これが事実であれば、珪藻に空間的に近接して生息する細菌がデスチオビオチンをビオチンに変換し、珪藻におけるビオチン合成に対する鉄欠乏の悪影響を橋渡しする可能性がある。

ここで提示された新しいデータは、微生物によるデスチオビオチンの相互摂食が海洋におけるビオチンの利用可能性に大きく寄与していることを示唆しています。 デスチオビオチンをビオチンに変換する遺伝的基盤を持つ細菌の割合は、すべての分類群で均等に表されるわけではありません。 この能力を持つロゼオバクター属の細菌は比較的大きな割合を占めます。 この細菌群は藻類のブルームに大量に存在することが多く、植物プランクトン生物と密接に相互作用することが知られています[62、63]。 海洋ビオチンの利用可能性に対するデスチオビオチンの影響をよりよく理解するために、我々は、デスチオビオチンの添加によってその栄養要求性を克服できることが示されているロゼオバクター属のビオチン要求性細菌であるC. indicusを、光栄養性、真核生物のビオチン栄養要求性、P. ミニマム。 C. indicus がデスチオビオチンをビオチンに変換して自身の栄養要求性を克服する能力は、偏性共培養における P. 最小値をサポートするためのビオチンの放出をもたらさなかった。 デスチオビオチンに加えて基質を共培養物に添加することにより、細菌の増殖がP.ミニマムによって阻害されないことを示すことができました。 共培養における両方のビオチンの添加による定常期および増殖における細菌細胞数の増加も、いずれかの相互増殖阻害を除外した。 私たちのデータが示すように、たとえ私たちの実験設定のように従属栄養細菌が有機炭素化合物の供給に依存しているとしても、特定の細菌はビオチンに変換されたデスチオビオチンを環境と必ずしも共有するわけではありません。 この実験のように、ビオチンが直接供給されないとしても、自然環境では、ずさんな摂食やウイルス感染によって細胞内ビオチンが利用可能になると考えられます。

我々は、ビオチンシンターゼ (BioB) を依然としてコードしているビオチン栄養要求性細菌が、低濃度のビオチン前駆体であるデスチオビオチンの供給によって増殖できることを示しました。 デスチオビオチンの取り込みによってビオチン栄養要求性を克服する能力は、水生細菌の中で非常に高いようであり、温帯南部や亜南極大西洋などの中栄養海洋地域でもかなりの割合を占めている。 デスチオビオチンが海洋環境で発生することはすでに知られていましたが、デスチオビオチンがビオチン原栄養細菌によっても高濃度で排泄されることを示すことができました。 我々の結果は、デスチオビオチンが海洋の栄養要求性細菌群集の大部分にとって重要な役割を果たしており、ビオチン前駆体が海洋ビオチン循環においてこれまで知られていなかった重要性を持っていることを示唆している。 海洋では、単純なビオチン交換を超えた複雑な微生物のビオチンとビタマーの相互作用が考えられるため、より徹底的に調査する必要があります。

現在の研究中に生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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RV ゼンケンベルグの船長と乗組員のサポートに感謝します。 この研究は、地域横断共同研究センター ローズオバクター (TRR51) 内のドイツ研究機関によって支援されました。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

オルデンブルク大学海洋環境化学生物学研究所、Carl von Ossietzky Str. 9-11、D-26129、オルデンブルク、ドイツ

ゲリット・ウィーンハウゼン, ステファン・ブルンス, サビハ・スルタナ, レオン・ドルゴッシュ, ルナ＝アグリッピーナ・グルーン, ハインツ・ウィルクス & マインハルト・シモン

オルデンブルク大学ヘルムホルツ機能海洋生物多様性研究所 (HIFMB)、Ammerländer Heerstraße 231、D-26129、オルデンブルク、ドイツ

マインハルト・シモン

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GW は実験の大部分を設計および実行し、データ分析の大部分を実行し、原稿を書きました。 SSは共培養実験を実施して細菌培養実験を支援し、LAGは細菌培養実験と細胞数測定を支援し、LDはメタゲノム解析の基本的なバイオインフォマティクス評価を実行しました。 SB と HW は海水サンプルを収集し、ビオチンとデスチオビオチンの LC-MS 分析を実行し、MS は原稿の執筆に貢献しました。 著者全員が注意深く原稿を修正しました。

ゲリット・ウィーンハウゼンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Wienhausen, G.、Bruns, S.、Sultana, S. 他海洋細菌のビオチン前駆体であるデスチオビオチンの、ビオチン栄養要求性の逃げ道としての役割の見落とされています。 ISME J 16、2599–2609 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41396-022-01304-w

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受信日: 2022 年 4 月 28 日

改訂日: 2022 年 7 月 19 日

受理日: 2022 年 7 月 28 日

公開日: 2022 年 8 月 13 日

発行日：2022年11月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01304-w

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