クライオ

Scientific Reports volume 12、記事番号: 9930 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

極低温電子顕微鏡は、生物対象を研究するための強力なツールになりました。 非生物対象物 (溶液、ゲル、分散液、粘土) については、極低温顕微鏡検査の結果の解釈に関する論争が依然として進行中であり、構造をサンプルの現実に近い状態として考えるか、または凍結アーチファクトとして考えるかという 2 つの相反する傾向に分かれています。 この研究では、凍結固定構造と非凍結構造を比較するために、一連の安定な水溶液および分散液 (寒天、カオリン、モンモリロナイト、ナノ粒子) の微細構造を低温 SEM および共焦点 LSM によって調査しました。 研究対象の系 (寒天、カオリン、モンモリロナイト、NP) に関するこれら 2 つの方法の間に注目された相関関係により、秩序ある微細構造がこれらの系の固有の特徴であることがわかりました。 微細構造の寸法におけるいくつかの不一致が議論され、バルク層と界面層の違いに規定されました。 おそらく、NaCl 溶液は、電解質の異常特性に影響を与える可能性がある純水クラスターと溶媒和された Na+ および Cl- イオンの動的 (フェムト秒レベル) 微細構造も持っています。

30 年以上前に極低温電子顕微鏡 (cryo-EM) が発見されて以来、この分野では多くのデータが蓄積されてきました 1,2。 このイメージング技術により、不可逆的な構造変形を引き起こす乾燥を行わずに、標本を本来の水性環境でマイクロおよびナノスケールで観察することができます。 極低温剤により水が固まる「凍結固定」により観察が可能になります。 後者は、この技術における重要なステップです。超高速凍結は、元の構造をそのままに保ちながら、氷の結晶の成長を防ぎます。 凍結固定は通常、試料を凍結剤 (窒素スラッシュ、プロパン、エタンなど) に浸し、続いて破壊 (試料の内部構造を観察するため) および昇華 (つまり、アイス エッチング) を行うことで実現されます。水層のない構造を観察します。 今日、クライオ EM 技術は生物対象を研究するための強力なツールになりました。 凍結固定状態と非凍結状態での微細構造の一致についての長期にわたる議論は、クライオ EM の結果が、生体標本のより高密度な構造要素 (骨格、膜など) の一部の実際の状態に近い状態を反映しているという合意により完了しました。 )1、2。 このコンセンサスは、異なるイメージング技術間の相関関係を示す蓄積されたデータに基づいていました。 液体およびゲル状の生物学的成分 (粘液、細胞内および細胞外の液体など) に関しては、低密度構造の視覚化の難しさ (低コントラスト、可動性など) に起因する可能性があるという疑問がまだ残っています。 。 この問題を解決する方法の 1 つは、湿ったサンプルを自然に近い状態で高解像度で観察できる技術を開発することです。 この方向に向けて、倒立型走査型電子顕微鏡（取り外し可能な開放培養皿を備えたもの）と蛍光顕微鏡を組み合わせた新しい大気SEM（ASEM）の開発が報告されている3。 ASEM を使用すると、大気圧で水溶液（電子透過性 SiN 膜でカプセル化）中のサンプルの上部と底部から同じ領域を準同時に観察できます。 この技術を使用して、神経結合、骨芽細胞、小胞体、骨組織、細胞エンドサイトーシスおよび有糸分裂が画像化されています 3,4。

生物学的対象物と比較すると、非生物学的水系（溶液、分散液、ゲル、粘土など）は水中に明確な（密な）相境界を持たず、そのクライオ EM 結果の解釈は依然として曖昧であり、2 つに分かれています。相反する傾向。 ある傾向によれば、凍結固定サンプルで観察される微細構造は、水性微結晶形成の結果、つまり凍結アーチファクトとして解釈されます5、6、7、8、9、10、11。 後者は、溶解/分散した物質が氷結晶の周囲に向かって拡散し、構造の形成につながるときに現れます7。 別の傾向として、低温固定サンプルの微細構造は、現実に近い状態であると考えられています。 この観点は、例えば発泡破砕流体、リンゴ由来のペクチンで形成されたエマルション、ナノ粒子分散液、鉱物粘土8、11、12、 13、14、15。 微細構造寸法の顕著な違い（LSM とクライオ EM の結果を比較した場合）が解釈されず、混乱を招く8。 低温固定された微細構造に関する矛盾した意見は、溶媒中に均一に分布した分子/イオン/粒子としての溶液およびコロイドについて一般に受け入れられている概念と実験結果が矛盾していることを示しています16。 したがって、非生物サンプルの極低温顕微鏡観察の解釈に関する論争は依然として進行中であり、この問題を解決するにはさらなる研究が必要です。

もう 1 つの重要な問題は、水のガラス化および/または凍結固定中に形成される氷の結晶のサイズに関連しています。 純水は、約 106 K/s の急速な凍結速度 (「臨界 (最小) 冷却速度」とも呼ばれます) で薄層または小さな液滴としてガラス化できることが知られています 2,17,18。 溶質が存在すると、臨界冷却速度が桁違いに低下します。 さまざまな溶質（エタノール、メタノール、塩化ナトリウム、グリセロール、エチレングリコール、ブドウ糖など）の場合、臨界冷却速度は濃度の指数関数であり、溶質のストークス半径と相関します17。 しかし、クライオ EM の実践では、達成される冷却速度は依然として理論上の限界をはるかに下回っています 18。 サンプル内の結晶氷の体積分率は十分に小さいため、高解像度の再構成を妨げるものではないと考えられています 2,18。 つまり、水中に明確な界面境界がないサンプルの場合、クライオ EM 測定で実際に観察されるものは何なのか、サンプルの構造なのか、それとも凍結アーチファクトなのかという疑問が残ります。 動的溶媒和物の微細構造が液体状態で存在し、凍結固定の瞬間に「停止」したのか、それとも微細構造が凍結の瞬間に作成されたのかを観察しますか? この問題は、溶液の凍結固定構造と、異なる化学的性質の溶質（粘土鉱物、多糖類、コロイドゲルなど）の分散液との間の明らかな類似性によってさらに複雑になります。蜂の巣状、海綿状、およびラメラ状の微細構造が一般的に観察されています10、11、14。 、15． 微細構造におけるこれらの類似性は、通常、現実を表していない凍結加工品の存在の証拠として解釈されていました8,9。

この研究の目的は、低温走査型電子顕微鏡を用いて、安定した水溶液と、異なる化学起源を持つ物質（寒天、カオリン、モンモリロナイト、極小酸化鉄、銀ナノ粒子（MAg NP））の分散液の微細構造を調査することでした。 (クライオ SEM) と共焦点 LSM を使用して、凍結固定と非凍結の微細構造を比較します。 どちらの方法でも、サンプルは同様の体積の液滴として調査されました（薄層としてではなく、その構造はバルクの微細構造とは大きく異なり、相間相互作用に依存する可能性があります19）。 さらに、NaCl 溶液 (0.2 ～ 20 wt%) の低温 SEM 研究を実施したところ、高度に秩序化された濃度依存の微細構造が観察されました。 溶媒和された Na+ および Cl- イオンと液体状態の純粋な水クラスターの動的構造の仮定が行われました。

私たちの研究では、クライオ SEM および共焦点 LSM 測定中、標本は大量に保たれました。 薄層の微細構造は、相境界相互作用に強く依存するバルク物質の微細構造とは大きく異なるため、これは重要です19。 クライオSEMでは、標本は標本スタブの穴に配置または注入されます（図1a）。 LSM測定用のサンプル準備は、体積を与える（層の厚さを増やす）ゴムガスケットを使用して実行されました（図2a）。 蛍光色素 (フルオレセイン、ローダミン B、Atto 550 NHS) をサンプルに導入し、超低レーザー出力 (0.01 ～ 0.15 mW) を使用することで、測定中のサンプルの加熱、歪み、水の蒸発を最小限に抑えます。

ローダミン B を含む寒天ゲルと、クライオ SEM 測定用に準備されたゲルを備えた 10 mm アルミニウム ホルダーを備えた標本シャトルの写真 (a)。 ローダミン B を含む寒天ゲルの低温 SEM 画像 (b)。

ローダミン B を含む寒天ゲルと、共焦点 LSM 測定用に調製されたゲルを含むスライドガラスの写真 (a)。 ローダミン B を含む寒天ゲルの共焦点 LSM 画像（励起波長 561 nm、レーザー出力 ~ 0.14 mW）：「島」（b）、球状（c 左および中央の画像）および層状構造（c 右）。 規則正しい微細構造（d）。 コントラストと明るさを調整しました。

ローダミンBを含む寒天ゲルの低温SEM測定中に、不規則な形状（サイズ20〜400μm）とギザギザのエッジを備えた無秩序に混合された「島」のように一致する海綿状と層状の2種類の微細構造が観察されました（図1b）。 。 海綿状の微細構造はより細かく、〜 1 μm スケールですが、層状の微細構造はより大きく、〜 10 μm スケールです。 「アイランド」は、「アイランド」のバルク微細構造とは異なる薄い層であるシェルによって、より大きなスケールのラメラ微細構造から分離されています（図1b、2列目）。 ラメラは最大 100 μm の距離で厳密に配向されていますが、単一のラメラ要素は不連続です (図 1b、下段)。 クライオ SEM 測定により、ローダミン B を含む寒天ゲル中に秩序ある微細構造が存在することが示されました。

ローダミン B を含む寒天ゲルの共焦点 LSM 画像からも、不規則な形状の「島」が明らかになりました (図 2b)。 クライオ SEM の結果と同様に、「アイランド」はサイズが 20 ～ 400 µm の不規則な形状を持つ体積構造です。 ほとんどの場合、「島」および「島」間の空間は均一に見え、微細構造の秩序は見えません。 それにもかかわらず、「島」がガラス上にある場合、または「壊れた」場合、主にスライドガラスの境界近くで、微細構造の秩序化の明確な例がいくつか見つかりました（図2c〜d）。 特に、一部の「島」は、列をなして積み重なった小球 (直径約 20 μm) で構成されていることが判明しました。 列の幅は約 40 μm でした (図 2c、左、中央)。 このような小球は、低温 SEM 研究では観察されませんでした。 また、「島」の境界にも層状構造が見られました。 層間の距離は 8 ～ 12 μm 程度でした (図 2c、右)。 図2dに示されている高度に秩序だった細長い（周期性〜5μm）および多孔質（〜10μmスケール）構造は、クライオSEM測定で観察されたラメラおよび海綿状構造と相関しています（図1b、最下行を参照）。 したがって、構造を開くステップ（水の除去、破砕、昇華）を行わずに標本の共焦点LSM測定を行うと、凍結していない寒天ゲルに微細構造が存在する証拠が得られます。

我々の以前の研究では、天然抽出物（Z. officinale、A. muscaria、S. crista）を用いて合成された MAg NP は、独特の微細構造を持つ安定した親水コロイドを形成することが示されています 14,20,21。 天然抽出化合物 (多糖類、プロテオグリカンなど) がこれらの NP 上に表面層を形成し、ハイドロコロイドの高い安定性を実現します。 NP 親水コロイドの高度に秩序化された微細構造は、主に平行な縞 (ラメラ) とスポンジ状の構造を示しています。 ローダミン B の導入（LSM イメージングのため）、および親水コロイド組成のあらゆる変化は、親水コロイドの微細構造に影響を与える可能性があります。 そのため、ローダミン B を含む MAg NP ハイドロコロイドに対してクライオ SEM および LSM イメージングが実行されました。 したがって、クライオ SEM 測定により、ローダミン B を含む MAg NP には、異なるスケールのラメラやスポンジなどの異なるタイプの微細構造が含まれていることが明らかになりました ( ~ 1 μm および ~ 10 μm、単一要素間) (図 S2)。 クライオSEM EDS測定により、微細構造要素がNPによって形成されていることが確認されました。FeおよびAg元素が微細構造要素内にあり、O（水から）がそれらの間にあります（図S2、a）。 微細構造要素の高倍率画像は、それが100 nmサイズの小球（溶媒和シェルを備えたナノ粒子）で構成されていることを示しています（図S2、b）。 また、サイズ 30 ～ 100 μm のより大きな丸い形状が多数観察されました (図 3、黄色の点線でマーク)。 これらの丸い構造は、内側が 10 μm スケールのラメラまたは海綿状構造、外側が微細スケール (≤ 1 μm) の殻で構成されています (図 3、下の画像)。

ローダミン B を含む MAg NP ハイドロコロイドの滴と、クライオ SEM 測定用に準備されたサンプルを備えた 10 mm アルミニウム ホルダーを備えた標本シャトルの写真 (a)、ローダミン B を含む MAg NP ハイドロコロイドのクライオ SEM 画像: 丸い構造は点線で囲まれています。行(b)。

ローダミン B を含む MAg NP 親水コロイドの共焦点 LSM 測定により、不規則で小さいスケール (約 5 ～ 10 μm) と大きな丸い形状 (20 ～ 100 μm) の 2 つの構造が共存していることが明らかになりました。 図 4c は、励起波長 514 nm および反射モードでのこのハイドロコロイドの共焦点 LSM 画像を示しています。 反射モードでは、丸みを帯びた構造の明確なエッジ輪郭が示され、2.5 D シミュレーション (x、y、強度) では、観察された構造のエッジでの集中的な反射が確認されました。 観察されたより大きな丸い形状は、クライオ SEM 研究中に観察されたものとサイズと形状が似ています。 これらの丸い構造の均一性は、低温SEM測定で観察された小さな構造のシェルの存在に関連している可能性があります（図4、下の画像）。

ローダミン B を含む MAg NP 親水コロイドの滴と、共焦点 LSM イメージング用に準備されたゴム製ガスケットを備えたガラス スライドとそれらの間に標本を挟んだ写真 (a)。 共焦点 LSM 画像 (励起波長 514 nm、レーザー出力 0.01 mW) (b); ダブルチャネル測定 (励起 514 nm および反射モード)、2.5 次元 (2.5D) シミュレーション (x、y 軸、強度) (c)。

次の一連の実験では、フルオレセインを含むカオリン粘土をクライオ SEM および共焦点 LSM イメージングに使用しました。 カオリン (Al2(OH)4Si2O5) 粉末は親水性で水に不溶で、安定した親水コロイドであるカオリン粘土を形成する可能性があります。 より良い蛍光シグナルを提供するために、ローダミン B とフルオレセインを含む 2 種類のカオリン粘土が調製されました。 ローダミン B 色素はイメージングを改善しませんでした (図示せず)。これは、カオリン粒子へのローダミン B の吸着不良に関連している可能性があります (この色素は水によく溶け、ほとんどがカオリン粘土の水相に存在します (上澄みは着色されています))。 フルオレセインはカオリン粒子 (無色上清) に対する親和性が高く、共焦点 LSM イメージング中にコントラストが向上します。これは、水への溶解度が低いこと (1 M NaOH、50 mg/ml に可溶) とカオリン粒子への吸着性が高いことに関連している可能性があります。 フルオレセインを含むカオリン粘土の低温SEM測定により、ラメラとスポンジの微細構造が明らかになりました（図5）。 これらの構造の壁は、平らなマイクロプレート、つまりカオリン粒子（図5bの黄色の点線で囲まれた部分）で構成されています。

フルオレセインを含むカオリン粘土の滴と、窒素スラッシュプランジ凍結用に準備されたアルミニウムホルダー内のカオリン粘土を含む標本シャトルの写真 (a)、フルオレセインを含むカオリン粘土の低温 SEM 画像 (b)。 共焦点LSMイメージング用の、フルオレセインを含むカオリン粘土、ゴム製ガスケットを挟んだカオリン粘土を挟んだスライドガラスの写真(c)。 励起波長 405 nm、レーザー出力 0.002 mW (明 - カオリン、暗 - 水) で得られた共焦点 LSM 画像。 カオリンマイクロプレートの平行配列の例は、黄色の破線で概説されています (d)。

共焦点LSM測定により、カオリンマイクロプレートの平行配置という特徴的な特徴を備えたカオリンマイクロプレートのかなり無秩序な分布が明らかになりました（図5d、明るいコントラスト-カオリン、暗い-水）。 カオリンマイクロプレートの平行配列のいくつかの例は、図5dに点線で囲まれています。 後者の観察は、クライオ SEM 測定と相関しています。

研究の継続として、別の鉱物粘土であるモンモリロナイトが低温SEMおよび共焦点LSMイメージングに使用されました（図6a、c）。 モンモリロナイト ((Na,Ca)0.33(Al,Mg)2(Si4O10)(OH)2・nH2O) 粉末は親水性で水に不溶で、安定した親水コロイド、つまりモンモリロナイト粘土を形成する可能性があります。 共焦点 LSM イメージングを改善するために、蛍光色素、フルオレセインと Atto 550 NHS エステルを含むモンモリロナイト粘土の 2 つのサンプルを調製しました。 クライオSEM測定により、モンモリロナイト粘土の多孔質海綿状微細構造が明らかになりました（図6b）。 この微細構造のスケールは 3 ～ 4 倍異なりました (図 6b、最初の行、〜 4 μm スケールと〜 11 μm スケールの微細構造を示しています)。 共焦点 LSM 測定 (図 6d) からも、以前に発表された結果と相関する高度に多孔質の穿孔構造が明らかになりました 2,8,9。 ここでは、細孔サイズは主に小さく、約 1 μm ですが、より大きな細孔 (5 ～ 20 μm) が 1 つ含まれています。

フルオレセインを含むモンモリロナイト粘土の写真、クライオ SEM 用のサンプルを備えた標本シャトル (a)、フルオレセインを含むモンモリロナイト粘土のクライオ SEM 画像 (b)。 フルオレセインを含むモンモリロナイト粘土、ゴム製ガスケットを備えたスライドガラス間に滴下した共焦点 LSM イメージング用の写真 (c)。 励起 405 nm、レーザー出力 0.002 mW で得られた共焦点 LSM 画像（明 - モンモリロナイト、暗 - 水）（d）。

さらに、蛍光染料 Atto 550 NHS エステル (MFCD05865403) をモンモリロナイト粘土に導入しました。 この蛍光色素は DMSO に可溶で、モンモリロナイト粒子 (無色上清) に対して親和性があります。 Atto 550 NHS エステルを含むモンモリロナイト粘土の目視観察により、この染料の添加により粘度が低下し、流動性が増加することが明らかになりました。 後者は、DMSOの添加によるモンモリロナイト粘土の表面張力の減少に関連しており、表面張力は水の表面張力よりも著しく低い(水とDMSOでそれぞれ71.9および42.3 mN.m-1 (303.2 Kで))22。 流動性の増加（粒子の高速移動）により、共焦点 LSM 測定はゴム製ガスケットを使用せずに実行され、粘土をガラスカバーで覆い、サンプルの厚さを減少させました（約 300 μm）。 共焦点 LSM 測定 (励起波長 561 nm、超低レーザー出力 ~ 0.01 mW) により、真っ直ぐで長い構造、つまり線 (ラメラ) が明らかになりました (図 7a)。 線はグループ化されており、非常に平行でした。 それらは鋭角 (~38°) も形成しました。 我々は、ラメラ構造の観察を、鉱物粘土とスライドガラス表面の間の相互作用（親和性）の向上（粘土の表面張力の低下と湿潤性の向上による）と関連付けます。 興味深いことに、クライオSEM測定中に、同様の鋭角構造がモンモリロナイト粘土表面、サンプル/空気境界上に観察されました（図7b）。 これらの結果は、モンモリロナイト粘土が、添加された蛍光染料とおそらく層の厚さに応じて、さまざまなタイプの微細構造、つまり均一な多孔質の穴あき構造と高度に平行な長い線（すなわちラメラ）を明らかにする可能性があることを示しました。 これらの結果は、共焦点 LSM 測定中に観察されたモンモリロナイト粘土の微細構造が、粘土とガラスの境界における界面相互作用に強く依存していることを示しています。 結論として、フルオレセインを含むモンモリロナイト粘土の低温SEMおよび共焦点LSM測定の結果は相互に相関しており、よく組織化された微細構造の存在を示しています。

Atto 550 NHS エステルを含むモンモリロナイト粘土の共焦点 LSM 画像 (励起波長 561 nm、レーザー出力 0.012 mW、明 - モンモリロナイト、暗 - 水) (a); モンモリロナイト粘土の表面 (空気/粘土境界) のクライオ SEM 画像。下の画像は、クライオ SEM (左) と共焦点 LSM (右) 技術 (b) で観察された構造間の類似性 (点線で示された鋭角) を示しています。モンモリロナイト粘土/空気、およびモンモリロナイト粘土/ガラスの境界。

研究の継続として、超純水と NaCl 溶液 (0.2 ～ 20 wt%) をクライオ SEM 技術を使用して調査しました。 超純水では均質な点状の表面が明らかになりましたが（図S3、最初の行）、NaCl溶液（0.2重量％）では薄い壁を持つ不連続な層状構造が明らかになりました。 ラメラ間の距離は 10 ± 2 μm でした。 NaCl 濃度 0.8 および 0.9 wt% では、ラメラ壁はより厚く、より連続的になりました。 ラメラ構造は、互いに異なる角度で配向したドメインを形成しました。 NaCl 濃度が 1.1 ～ 1.5 wt% の範囲にある場合、ラメラ間の架橋が現れ、ラメラ構造が細胞様に変化しました。 ここでは、壁の厚さが増加し、壁に複数の穴が依然として観察された。 NaCl 濃度 2.0 および 5.0 wt% では、微細構造は完全に細胞状になりました。 細胞状要素は細長く、その横方向の寸法は約 10 ± 2 μm です。 NaCl 濃度 10.0 および 20.0 wt% では、細胞様要素のサイズは減少し (横方向の寸法 5 ～ 8 μm)、壁の厚さはさらに増加し​​ました。 要素セルの縦方向と横方向の寸法は互いに接近しました（図S3）。 壁の微細穴などの特徴は、濃度範囲0.8〜2.0重量％のNaCl溶液で観察されました（図S4）。 微細孔 (直径 0.5 ～ 2.0 μm) の存在は、気泡として規定されることもあれば、微細構造壁の連続性をもたらす特定の特徴とみなされることもあります。

クライオSEM元素マッピングは、NaおよびCl元素が主に微細構造の壁に位置しているのに対し、O（H2Oから）は壁の間に位置していることを示しました（図8a）。 Na および Cl 元素は主に微細構造壁に存在します (プラズマスパッタリングに使用された Pt 元素の均一な分布は、微細構造元素が電子の流れに影響を与えるサンプルの表面を超えていないことを示しています)。 これらの壁の構造を（ナノスケールレベルで）詳細に調査したところ、サイズが50nm未満の丸い構造で構成されていることがわかりました（図8b）（技術的な理由により、観察された球体に対する「その場での」クライオSEM EDS測定は実行されませんでした）制限: このような高倍率 (× 100,000) では、EDS スペクトルの収集に必要な時間 (約 30 秒) が経過すると、電子ビームのエネルギーにより分析領域が溶けて破壊されます。 濃度範囲が 0.2 ～ 5.0 wt% の NaCl 溶液では、丸い構造がランダムに詰め込まれて溶媒和壁を形成しますが、濃度 10.0 または 20.0 wt% では、細長いワイヤ (厚さ約 100 nm、長さ 3 μm 以下) を形成します。次に、複雑なパターンで組織化され、細胞様の微細構造の壁を形成します。 マイクロスケールレベルのNaCl溶液のクライオSEM画像は、複雑な体積微細構造を示しており、濃度が増加すると、不連続な層状構造（0.2〜1.5重量％）から細胞様構造（2.0〜20.0重量％）に変化します（図S5、 S6)。 NaCl 溶液の三次元 (3D) 微細構造は、凝集した細胞様要素の異なる方向を向いたドメインの量として説明できます。 ドメインのサイズは各次元で約 100 ～ 500 µm です。 溶媒和壁の厚さは、NaCl 濃度とともに増加しました。 この機能の詳細な調査は、補足図S7、表S1〜S3に示されています。

10 wt% NaCl 溶液の Cryo-SEM EDS 元素マッピング: Na、Cl、O、および Pt 元素分布。 Pt はプラズマ スパッタリングに使用され、その均一な分布は、サンプルからの微細構造要素が電子の流れに影響を与えて表面を超えていないことを示しています (a)。 NaCl 溶液 (0.8 ～ 20 wt%) の低温 SEM 画像: ナノスケール レベルの微細構造 (b)。

注目されたもう 1 つの興味深い特徴は、Na および Cl 原子濃度の化学量論比からの偏差、つまり分析領域に応じて存在する Na または Cl 原子の量でした。 一部の分析領域では、Na 原子と Cl 原子の比率は 1:1.88 でした。 Na 原子と Cl 原子の分布間の不均衡は、475 ～ 1230 µm2 (約 43.1 ∙ 10-6 mm3、X 線透過率 ~ 3.5 µm) の範囲の領域で観察されました。 このような不均一性は、特定の反応が局所的に優勢になり、HClO、NaOH などの酸性または塩基性化合物の形成を引き起こす可能性があります。この結論は、凍結した NaCl 溶液の微小スケールでの pH の不均一性が確認された以前の研究と相関しています 23,24。 特に、凍結した 20 mM NaCl 溶液の溶媒和壁内の pH 勾配 ΔpH = 0.2 の存在は、レシオメトリック蛍光顕微鏡を使用して検出されました 23。 別の研究では、NaCl の存在下での凍結および解凍のプロセスにより pH 値が大きく変化し、没食子酸の分解を引き起こす可能性があることが示されました 24。

観察された NaCl 溶液の高度に秩序化された微細構造は、現実に近い状態を反映していると想定できます。つまり、純粋な水クラスターと高密度に充填された溶媒和 Na+ および Cl- イオンの動的微細構造は、この系の固有の特徴です。 この仮定は、電解質の異常などを理解するのに役立つ可能性があります。

一般に、水は広範な水素結合ネットワークにより高度に構造化された液体であると考えられています。 ただし、構造をどのように定義するかについては合意がありません 25,26。 過去数年間に、水分子は、二量体、四量体、六量体、ナノクラスターなど、さまざまなタイプの構造を形成する可能性があることが判明しました27。 このような水の構造は、2D 表面 (Ag(111)、Cu(110)、表面上の Au(111)、NaCl(100) 二重層によってサポートされた NaCl(001) 膜上など) 上で視覚化されています 27,28,29 、30、31。 特に、水は、Cd(0001) 表面上で水二量体が優勢なさまざまなクラスターに凝集することがわかりました 27。 興味深いことに、非晶質氷ナノフレークは水二量体のみから構築されました。 水二量体の極めて高い安定性は、水の双極子モーメントの吸着誘起強化に起因することが実証されました 27。 塩溶液では、2 種類の水分子が共存します。1 つはイオンと相互作用しない水分子、もう 1 つはイオンと直接相互作用して動的水和シェル (溶媒和物層) を形成する 25、26 です。 溶媒和物層中の水の構造は、相互作用していない水の構造とは異なることが示されており、異なる特性を明らかにしています（たとえば、純水よりも平均密度が大きい）26,32。 水和イオンはピコ秒の時間スケールでは硬い球体と見なすことができるため、溶液は浮遊球体を含むバルク液体水として想像できます 33。 ここで、溶液の巨視的特性の変化（例、粘度の増加）は、通常、純水の水素結合構造の変化に関連していました 34,35。 しかし、フェムト秒ポンププローブ分光法による高濃度のMg(ClO4)2、NaClO4、Na2SO4溶液中の水分子の配向相関時間を測定したところ、イオンの添加は外部水分子の回転動力学に影響を及ぼさないことが明らかになった。イオンの最初の溶媒和シェル33。 純水および NaClO4、Na2SO4 の高濃度溶液について得られた結果は、水に結合した OH 基の異方性減衰が、高濃度の ClO4-、SO42-、および/または Na+ イオンの存在によって影響を受けないことを示しました。 これは、高濃度の塩溶液であっても、溶媒和シェルを有するイオンが純粋なバルク水と共存することを示しており、これは我々の発見と相関している。 さらに、粒子の規則的なクラスターの形成が分散液の流れ方向に沿って視覚化され、コロイド分散液のずり粘稠化の原因として解釈されています 36。

この研究では、低温 SEM および共焦点 LSM 技術を使用して、安定した水系の微細構造を調査しました。 結果は、寒天ゲル、鉱物（モンモリロナイトおよびカオリン）粘土、および NP 親水コロイドについて、低温 SEM および共焦点 LSM 測定によって観察された構造的特徴の一致を示しました。 特に、寒天ゲルの場合、そのような一般的な微細構造の特徴は、サイズが 20 ～ 400 μm の不規則な形状を有する体積構造、層状構造、高度に秩序だった細長い多孔質構造でした。 MAg NP の共通の特徴は、サイズが 20 ～ 100 μm の丸みを帯びた形状でした。 カオリン粘土の場合、特徴的な特徴はカオリンマイクロプレートの平行配列であったが、モンモリロナイト粘土の場合、それは多孔質の海綿状の微細構造であった。 使用した 2 つの手法の結果間で観察された類似の特徴に加えて、微細構造の全体像と寸法の不一致などの相違点もありました。 後者は、測定中にさまざまなサンプル観察ゾーンに指定される場合があります。クライオ SEM では、バルク構造が観察されます (サンプルの破壊により)。一方、共焦点 LSM 検査では、ガラス表面近くの薄い (数マイクロメートル) 層が調査されます (たとえば、1 AU では深さは約 1 μm です）（図 9a のスキーム）。 知られているように、バルクの微細構造は表面層とは大きく異なります。 図9bは、バルクから中間​​層を通って表面まで、多糖類ゲル(空気/ゲル境界)で生じる微細構造スケールの遷移の例を示しています。 スケールの遷移は、バルクの粗いスケールの微細構造から表面の細かいスケールに移行することもあり、またその逆に、バルクの微細なスケールから表面の粗いスケールに移行することもあります (図 9b)。 これらの観察は、水を含む非生物学的システム（つまり、水中に顕著な境界がないシステム）の共焦点 LSM 測定の結果が、ガラスとサンプルの相互作用（それらの間の親和性、濡れ性など）に強く依存することを示しています。 この結論は、上記の Atto 550 NHS を使用したモンモリロナイト粘土の共焦点 LSM 測定の結果によっても裏付けられています。 この蛍光染料を含むモンモリロナイト粘土は、粘土とガラス表面の間の親和性を向上させるために規定された高度に平行な構造を明らかにしました（比較のために、フルオレセインを含むモンモリロナイト粘土は多孔質の海綿状構造のみを示しました）。 したがって、表面近くの層（基板/サンプル、空気/サンプル）の微細構造は、バルクの微細構造とはスケールとパターンが大きく異なります。

共焦点LSMおよびクライオSEM測定におけるサンプル観察のスキーム(a)。 空気/ゲル境界における多糖類ゲルの表面からバルクへの遷移層(点線で囲まれた)を通した微細構造スケールの移動の例37(b)。 動的溶媒和微細構造のスキーム (c)。

安定した水を含むシステム（寒天、カオリン、モンモリロナイト、MAg NP）のクライオ SEM 測定と共焦点 LSM 測定間の相関により、秩序ある微細構造がこれらのシステムの固有の特徴であると結論付けることができました。 NaCl溶液は、純粋な水クラスターと高密度に充填された溶媒和Na+およびCl-イオンからなる動的（フェムト秒レベル）の規則的な微細構造も有すると考えられています（図9cの提案スキーム）。 微細構造の存在に関する仮定は、一部の水系 (電解質、分散液など) の異常な特性 (密度、粘度、pH など) を理解するのに役立ちます。

分析グレード試薬の寒天 (CAS 9002-18-0、A1296)、カオリン (CAS 1332-58-7)、モンモリロナイト (CAS 1318-93-0)、ローダミン B (CAS 81-88-9)、フルオレセイン (遊離酸) (CAS 2321-07-5)、CaCl2・2H2O (CAS 10035-04-8)、蛍光色素 Atto 550 NHS エステル (MFCD05865403)、ジメチルスルホキシド (DMSO) (CAS 67-68-5) は以下から購入しました。 Sigma-Aldrich であり、受け取ったまま使用されます。 純度 99.9% の塩化ナトリウム (CAS 7647-14-5)、水酸化アンモニウム (CAS 1310-73-2) は POCH SA から購入しました。GZY-P10 水システムからの超純水 (抵抗率 > 17 MΩcm) を実験全体を通じて使用しました。 クライオ SEM 測定には、脱イオン超純滅菌濾過水 (CAS 7732-8-5、Sigma-Aldrich) を使用しました。 共焦点 LSM 測定には、24 × 50 mm (Menzel Gläser) および 18 × 18 mm (Zeiss) のスライドガラス、およびゴム製ガスケット (O リング、13 × 1 mm) を使用しました。

この研究では、調製、物理化学的および生物学的特性評価が提供されている超小型酸化鉄および銀 (MAg) NP の親水コロイド 21 を使用しました。 MAg NP ハイドロコロイドは安定した水分散液を形成でき、高濃度 (≧ 37 mg/ml) ではコロイドゲルを形成します。 この研究では、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) イメージングのコントラストを向上させるために、蛍光色素ローダミン B を MAg ハイドロコロイド (ハイドロコロイド濃度: NPs-38.2 mg/ml、ローダミン B-49.2 μg/ml) に添加しました。測定中のサンプルの加熱と水の蒸発を最小限に抑えるため、超低レーザー出力を適用します）。 MAg ハイドロコロイド中のローダミン B の濃度は 49.2 μg/ml でした。 ローダミン B を添加した後、MAg ハイドロコロイドをボルテックスし、使用するまで 4 °C の暗所に保管しました。

ローダミン B を含む寒天ゲル (5 wt%) を調製するために、ローダミン B 溶液 (100 μl、2.95 mg/ml) を 4900 μl の水と混合し、寒天粉末 (250 mg) と混ぜ合わせました。 寒天ゲル中のローダミン B の濃度は 59 μg/ml でした。 寒天を溶解するために、調製した混合物を入れた耐熱ガラスを電子レンジに数分間入れ、沸騰を避けました。 冷却した硬質透明ゲルは、使用するまで 4 °C の暗所に保管しました。

カオリン粘土 (27.5 wt%) を調製するには、1.5 g のカオリン粉末を 5000 μl の水と混合し、1.6 mg のフルオレセイン、150 μl の 5 M NaOH、300 μl の CaCl2・2H2O (5 wt%) を加えました。混合し、２時間超音波処理し、室温の暗所に４８時間放置した。 カオリン粘土中のフルオレセインの濃度は 293.5 μg/ml でした。 調製したカオリン粘土は、使用するまで 4 °C の暗所に保管しました。

モンモリロナイト粘土（30 wt%）を調製するには、1.5 gのモンモリロナイト粉末を4550 μlの水と混合し、1.6 mgのフルオレセイン、150 μlの5 M NaOH、300 μlの5 wt％ CaCl2・2H2Oを加え、混合し、 ２時間超音波処理し、暗所、室温で４８時間放置した。 モンモリロナイト粘土中のフルオレセインの濃度は 320 μg/ml でした。 調製したモンモリロナイト粘土は、使用するまで 4 °C の暗所に保管しました。

蛍光色素 Atto 550 NHS エステルを含むモンモリロナイト粘土を調製するために、1 μl の色素原液 (1 mg/100 μl DMSO) を 1 ml の水で希釈しました。 次に、この溶液 200 μl を 300 μl の水、150 mg のモンモリロナイト粉末、10 μl の 5 wt% CaCl2・2H2O、10 μl の 5 M NaOH と混合しました。 モンモリロナイト粘土中の Atto 550 NHS エステルの濃度は 3.85 μg/ml でした。 調製したモンモリロナイト粘土は、測定前に 4 °C の暗所で 48 時間保管しました。

超純水を使用して塩化ナトリウム溶液 (0.2 ～ 20 wt%) を調製しました。

クライオ SEM 測定は、Quorum Technologies 製 PP3000T クライオ システム (SEM コールド ステージ、汚染防止装置、カラム搭載プレパレーション チャンバー、PrepDek 試験片プレパレーション デスク、ターボ ポンプ スタック、および CHE3000 冷ガス冷却システムを含む) を搭載した走査型電子顕微鏡 JEOL 7001F を使用して実行されました。 ）。 PP3000T クライオ システムは、窒素スラッシュ プランジ凍結法を利用してサンプルを急速凍結します。 液体窒素は、63 K (-210 °C) で幅広い圧力値で凍結します。 スラッシュ窒素に物体を突っ込むと、沸点 (-196 °C) の液体窒素に物体を突っ込むよりも急速に冷却されます。 高い冷却速度により、氷結晶の成長が防止され、氷結晶が核形成ステージに固定されます (サイズは非常に nm)。2 プロトコール (PP3000T ユーザーマニュアル v.1.4) に従って、試料の急速凍結をワークステーション (商標 PrepDek) で実行しました。試料の準備と操作、および制御電子機器。 液体サンプルは滴（約 30 μl）として、寒天ゲルはピースとして標本スタブの穴に表面上に突き出るように入れ、シャトルに取り付けました。 凍結後、標本は低温移送装置を使用してカラムに取り付けられた準備チャンバーに移送され、真空下で標本を清潔で湿気のない状態に保ちながら保管できます。 大きな低温表面を備えた準備チャンバーは、試験片の破砕、昇華、プラズマ スパッタ コーティングを行うための設備を提供します。 準備チャンバーでは、コールドステージ温度は 1 °C の安定性で約 -185 °C (試料の破砕およびスパッタリング時) に維持され、チャンバーの真空は 8.5・10-4 Pa の範囲でした。 ) は -90 °C で実行されました。 持続時間は標本によって異なり、特に指定がない限り実験的に選択されました（通常は 5 ～ 50 分）。 Ptターゲットを用いてプラズマスパッタ成膜を行った。 続いて、試料を準備チャンバーから観察のために SEM チャンバーに移しました。 電子顕微鏡の内部には、観察中にサンプルを凍結した状態に保つコールドステージがあります。 電子顕微鏡のコールドステージの温度は、-190 ± 2 °C (真空度 ～ 2.6・10-5 Pa) に維持されました。 凍結試料の二次電子画像を 5 keV で取得しました。 エネルギー分散分析 (EDS) は、X-Max 80 mm2 大面積 SDD シリコン ドリフト検出器 (Oxford Instruments) を使用して 15 keV で実行されました。 NaCl 溶液のクライオ SEM 測定は、金をスパッタリングした試験片スタブを使用して実行されました。昇華時間は -90 °C で 30 ～ 60 分でした。 クライオ SEM EDS 分析の昇華時間は 10 ～ 15 分に短縮されました (試料の表面を平らに保つため)。

寒天ゲル、鉱物粘土、および NP 親水コロイドの室温 (凍結なし) でのイメージングは​​、2 光子励起用のフェムト秒可変赤外レーザーを備えた共焦点 LSM Zeiss LSM 780 を使用して実行されました。 標本（30 µl または 4 × 4 mm のゲル片）をスライドガラス（24 × 50 mm）上に置き、その上にゴムガスケット（O リング 13 × 1 mm）を付け、ゴムガスケットの内側に置きました（測定中の試料の体積測定; ゴムパッドの厚さ ≈ 試料の厚さ) を測定し、別のスライドガラス (18 × 18 mm) で覆います (測定中の水分蒸発を減らすため) (図 2a を参照)。 すべてのサンプルの測定は、対物レンズ C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 (開口数 1.2) を使用し、低レーザー出力 (公称レーザー出力の 1% 未満、水分の蒸発とサンプル内のレーザーによる変化を低減するため) で実行されました。 、ゲイン 830。画像記録にはライン平均モードが適用されました。 サンプル中のローダミン B、フルオレセイン、および Atto 550 NHS 蛍光色素の濃度は、「溶液および分散液の調製」のセクションで前述しました。 ローダミン B を含む寒天ゲルは、レーザー励起波長 561 nm、発光範囲 585 ～ 735 nm で測定されました。 ローダミン B を含む MAg NP 親水コロイドは、励起波長 514 nm、発光 536 ～ 674 nm、および反射モードで測定されました。 2.5 次元 (2.5D) 画像 (x、y 軸、強度) は、2 つの画像を結合できる処理技術を使用して取得されました。 フルオレセインによるカオリンおよびモンモリロナイト粘土の測定は励起 405 nm で実行され、発光は 416 ～ 493 nm の範囲で記録されました。 Atto 550 NHS エステルを含むモンモリロナイト粘土をスライドガラスとカバースリップ (ゴムガスケットなし) の間に滴下し、励起波長 561 nm、発光 571 ～ 670 nm で測定しました。 すべての画像はスライドガラスの表面近くで記録されました。

この研究中に生成および分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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財政的支援は、ポーランド、ポズナンのアダム・ミツキェヴィチ大学のナノバイオメディカルセンターによって提供されました。 出版物のオープンアクセス費用の資金は、ポーランド、ポズナンのアダム・ミツキェヴィチ大学の ID-UB プログラムによって提供されました。 著者は、極低温走査型電子顕微鏡の協力と指導、実りある議論、コメント、記事の校正と編集をしていただいた Barbara Peplińska 博士に非常に感謝しています。 著者はまた、蛍光色素 Atto と超純水をご提供いただいた Bartosz Grzeszkowiak 博士と Weronika Andrzejewska 博士に感謝いたします。

NanoBioMedical Center、アダム・ミツキェヴィチ大学、61-614、ポズナン、ポーランド

オレナ・イヴァシチェンコ

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Ivashchenko, O. 寒天ゲル、ナノ粒子親水コロイド、鉱物粘土、生理食塩水の低温 SEM および共焦点 LSM 研究。 Sci Rep 12、9930 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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受信日: 2022 年 3 月 18 日

受理日: 2022 年 6 月 2 日

公開日: 2022 年 6 月 15 日

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